液相色谱-原子荧光光谱联用（HPLC-HG-AFS）技术对饲料及富硒酵母中硒形态的分析

■王金荣 付佐龙 邢 志 赵银丽 苏兰利

(1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450001；2.清华大学分析中心，北京 100084)

硒作为微量元素添加剂在饲料生产中广泛应用，单质的硒和硒化物不溶于水，不能被动物直接利用，因此水溶性的硒酸盐、亚硒酸盐和有机硒被作为促进畜禽生长的重要硒源。由于动物和人对硒的需要量与中毒剂量之间域值很窄，不同硒形态的毒性亦不同，因此准确地定性定量分析不同形态和价态的硒对饲料中硒的安全使用具有重要意义。

由于有机硒的生物学作用优于无机硒，对于有机硒的检测尤为重要。目前有机硒的检测方法尤其是食品中有机硒的检测研究相对较多，主要有荧光法、毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、极谱法、气相色谱法、凝胶色谱法、离子交换色谱、离子对液相色谱法以及一些多维分离技术和手性分离技术[1-2]。但对饲料中有机硒的分析，尤其是形态分析技术的研究相对较少。饲料中添加有机硒源主要以蛋氨酸硒、胱氨酸硒和酵母硒等形态的硒产品。Fotios Tsopelas等[3]用高效液相色谱法使用反相柱作为固定相在不同流动相条件下研究了硒酸盐、亚硒酸盐、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸等不同硒形态化合物的色谱条件，达到了对不同形态硒分离分析的目的。

本研究旨在以现有国内外对硒形态分析研究的基础上，拟采用液相色谱-原子荧光联用技术（HPLC-HG-AES）对饲料以及富硒酵母中的硒形态进行分析，以期建立饲料及酵母硒中硒形态分析的定性、定量方法，为对评价饲料中添加硒的生物有效性和安全性提供科学依据。

1 实验仪器及试剂

1.1 主要仪器

高效液相色谱仪LC-10A(日本岛津公司生产),RP-C18柱(Wondasil，5 μm，4.6 mm×150 mm)，原子荧光光谱仪（北京科创海光仪器有限公司生产，AFS-9800），Se空心阴极灯（北京有色金属研究院生产），离心机（上海飞鸽离心机，TDL-40B生产），微波消解仪（上海屹尧生产，EXCEL全功能型），纯水机（密理博贸易有限公司生产）等。

1.2 主要试剂

硒代半胱氨酸(Se-Cys)标准品(购自Sigma公司,纯度≥95.0%),硒代蛋氨酸（Se-Met）标准品(购自Sigma公司，纯度≥98.0%)，Se标准溶液[GBW(E)080136,100 μg/ml]，甲醇、乙酸、盐酸、硫酸、双氧水、硼氢化钠、氢氧化钠、硫脲等。实验所用试剂均为优级纯，色谱用试剂为色谱纯，水为实验室分析一级用水。

1.3 实验样品及制备

实验用饲料样品为市售肉鸡饲料，富硒酵母由市场购进，湖北安琪酵母股份有限公司生产。

标准品添加的饲料样品均是在河南工业大学饲料加工工艺实验室配制完成，饲料中未添加任何抗生素等药物添加剂。在实验室内配制含0.1%的蛋氨酸硒和胱氨酸硒预混合饲料，根据需要准确称取一定质量的含0.1%蛋氨酸硒和胱氨酸硒的预混合饲料配制至1 kg，配制过程逐级稀释混匀以保证样品的均匀性。混匀后的样品在分析前粉碎并过0.5 mm筛。

1.4 实验方法

1.4.1 样品预处理

根据文献，本实验设计样品提取液为去离子水及0.01 mol/l乙酸水溶液，提取条件分别为室温条件、沸水浴和超声波萃取，提取时间为6、12、24 h。处理后样品在4000 r/min条件下离心10 min，取出上清液，用0.45 μm针头式过滤膜过滤后用于分析。

1.4.2 标准溶液的制备

分别称取0.02 g（精确到0.1 mg）硒代半胱氨酸标准品和硒代蛋氨酸标准品用0.1%乙酸溶液定容至50 ml，并稀释100倍，得到浓度为4 mg/l标准溶液，用0.45 μm针头式过滤膜过滤。

1.4.3 仪器分析条件选择

利用紫外分光光度计进行扫描分析，确定蛋氨酸硒及胱氨酸硒的最佳检测波长。以乙酸溶液和甲醇作为流动相，通过梯度洗脱达到分离目的。采用优化后的液相色谱分离条件，与原子荧光光谱联用进行测定。液相色谱与原子荧光联用接口参照Lina Liang等[4]报道设计的HPLC-UVAFS流路，结合刘庆阳[5]提出的可使用TiO2光催化硫脲预还原Se(Ⅵ)手段，对现有的原子荧光光度计进行改进，设计解决了液相色谱与原子荧光光谱接口问题，并对本实验样品进行测定。

2 实验结果与分析

2.1 样品前处理方法优化

通过对去离子水及0.01 mol/l乙酸水溶液提取饲料及酵母硒中的有机硒，在室温条件、沸水浴和超声波萃取3种不同条件下的提取液中硒形态进行分析，并以蛋氨酸硒和胱氨酸硒标准溶液的保留时间进行对照。结果表明，用0.01 mol/l乙酸溶液为提取剂，用超声波萃取，经过12 h提取效率最高，因此，本实验以此条件作为饲料及酵母硒中有机硒的提取方法。而其中的无机硒包括Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)，可借助试剂的选择性消化：硝酸能氧化Se(Ⅱ)及单体硒为Se(Ⅳ)，不影响Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)；高氯酸能将Se(Ⅳ)氧化为Se(Ⅵ)；在硫酸冒烟过程中，部分Se(Ⅵ)会还原为Se(Ⅳ)[6]，进行进一步的分离。

2.2 样品的测定

2.2.1 饲料及富硒酵母中有机硒的形态测定

用0.01 mol/l乙酸水溶液对饲料及富硒酵母中硒进行超声提取12 h。之后将样品于4000 r/min离心10 min，取出上清液，并用0.45 μm针头式过滤膜过滤。富硒酵母中硒的加标回收率实验中样品的处理方法：先将一定量标准物质溶液加入富硒酵母样品中，待晾干后，处理方法同普通样品。按上述样品处理方法，对样品中有机硒形态以及标准溶液进行测定。

利用可扫描紫外分光光度计分别对硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸标准溶液在180～400 nm波长范围内进行扫描，结果表明，在210 nm附近二者均有较大吸收，因此液相色谱分离检测的波长设为210 nm。以0.1%的乙酸和甲醇作为洗脱液，根据时间梯度改变两种洗脱液的比例，以达到有机硒最佳的色谱分离条件(见表1)。根据此条件，对饲料及富硒酵母中的有机硒进行分离。原子荧光光谱检测在仪器推荐的硒检测参数基础上，根据样品溶液基质及仪器条件调整各参数，确定的最佳仪器参数为：负高压300 V；灯电流80 mA；原子化器高度8 mm；载气流量400 ml/min；屏蔽气流量900 ml/min；读数时间12.0 s；延迟时间1.0 s。根据上述优化的检测条件，对Se-Cys与Se-Met标准样品进行测定，确定样品组分见图1，并对饲料及富硒酵母样品中硒形态进行测定（见图2）。

表1 蛋氨酸硒及胱氨酸硒的梯度洗脱程序

图1 Se-Cys与Se-Met标准物质的图谱

由图2可以看出饲料中几乎不含有机硒，而饲料和富硒酵母在2 min左右所出的峰应该是无机硒。

2.2.2 饲料及富硒酵母中无机硒的形态测定

实验为测定饲料及富硒酵母中Se(Ⅳ)的含量，故采用2.1节所述前处理方法，分别采用HNO3体系，使用微波消解-原子荧光光谱法对饲料及富硒酵母中Se(Ⅳ)含量进行了测定，从文献[7-8]可知在此过程中有机硒中Se（Ⅱ）会转化为Se(Ⅳ)，因此对富硒酵母中Se(Ⅳ)的定量需减去其中有机硒的硒含量。

图2 饲料（a.未加标样品，b.加标样品）及富硒酵母（c.未加标样品，d.加标样品）中有机硒形态分析图谱

实验收集测定了2.2.1节中保留时间在1.5～2.5 min的样品洗脱液。并测定其中Se(Ⅳ)含量与上述方法对照。根据以上实验计算样品中Se(Ⅳ)、Se（Ⅵ）、Se-Cys、Se-Met以及总硒的含量结果见表2。并根据以上实验对加标样品测量计算有机硒形态加标回收率（见表3）。由表3可以看出采用本实验提取方法，回收率可达到70%～86.5%。从表2的结果中可以看出，对于市售的肉鸡饲料，其中的硒含量很低，并且主要以无机硒为主，Se(Ⅳ)占饲料中总硒含量的90%以上，说明肉鸡饲料中添加的硒主要为亚硒酸盐。对于饲用的富硒酵母，其中硒含量丰富，主要以有机硒形式存在，其中Se-Met中硒含量约占酵母中总硒含量的50%，Se-Cys约占30%，而无机硒不到20%。

表2 饲料及富硒酵母中Se(Ⅳ)、Se（Ⅵ）、Se-Cys、Se-Met以及总硒的含量(μg/g)

表3 饲料及富硒酵母中Se-Cys和Se-Met的加标回收率

3 小结

本文采用通过优化液相色谱条件，达到了对饲料及富硒酵母中不同形态硒的分离，并以原子荧光光谱作为检测器，对分离后的不同形态硒进行定量分析。以0.1%乙酸水溶液并辅以超声对饲料及富硒酵母中的硒进行提取，以C18柱分离，在时间为0、3、5、15 min范围内，以0.1%乙酸和甲醇作为流动相，甲醇梯度为5%、0.5%、15%、5%时，不同形态硒得到很好的分离。在本实验检测条件下，采集的市售肉鸡饲料样品中所含的硒都是无机硒，且90%以上都是以亚硒酸盐的形式存在；富硒酵母中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、Se-Cys以及Se-Met中Se含量分别占样品总硒含量的2.6%、14.6%、31.1%和51.7%，方法平均回收率为70%～86.5%。