红酵母利用玉米浆发酵产富含类胡萝卜素功能饲料的研究

■徐 凯 赵 筱 王金华 王永泽 李 超

（湖北工业大学生物工程学院，发酵工程教育部重点实验室，湖北武汉 430068）

玉米浆是利用玉米生产淀粉的主要副产品之一，其中富含氨基酸、蛋白质、维生素、无机盐等营养物质。它们用作饲料时存在氨基酸组成不合理，缺少赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸的问题，且玉米浆由于固形物含量低，储运、包装、使用等均不方便，存放期易变质；如将其自然排放，不但浪费了资源，而且造成环境污染。国内已开发出很多途径来解决上述问题。如何科学、合理的利用玉米浆已成为困扰整个玉米深加工行业的一大难题。利用玉米浆生产高蛋白酵母增色饲料是目前解决这一问题的有效途径。相对玉米浆所含蛋白，酵母细胞蛋白构成比较理想，几乎含所有的氨基酸，尤其是赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸，且含量高；还有，红酵母富含类胡萝卜素，作为一种非常有名的抗氧化剂，使传统的酵母类饲料在有高营养价值的同时，增添了很强的抗氧化、消除自由基能力，还可促进抗体的产生和增强宿主的免疫功能；在本实验室前期项目研究中我们还发现，包含类胡萝卜素的红酵母用在饲料行业还具有能使鸡鸭蛋着色的功能。综上所述该研究对丰富市场上增色饲料添加剂的种类和提高禽蛋品质及风味等方面都具有极为重要的意义。

本试验拟在前期筛选出的红酵母菌株D(Rho⁃dotorula sp.D)的基础上从碳氮源优化出发，研究了液态发酵的最佳培养基配方和发酵工艺条件，并采用1000 L发酵罐进行了中试规模的发酵生产和产品制备，以期为玉米浆的利用找到新的突破口。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

红酵母菌株D(Rhodotorula sp.D)，此菌株为海洋红酵母，由本实验室保藏。

1.1.2 试剂

酵母膏和蛋白胨及琼脂粉为进口（OXOID公司生产），其它试剂均为市售国产分析纯；葡萄糖结晶废糖液（以下简称母液）和玉米浆由山东某淀粉药业公司提供。母液里葡萄糖含量为50%；玉米浆中总氮含量为1%。

1.1.3 仪器

生物传感分析仪SBA-40D山东省科学研究院，7 L发酵罐（sartorius stedim Biotech GmbH37070 Gottigen Germany），15～200 L发酵罐（GUJS-15-100C镇江东方生物工程设备技术有限责任公司生产），1000 L发酵罐和喷雾干燥塔均由山东某淀粉药业公司提供。

1.1.4 培养基

斜面活化培养基（g/l）：麦芽汁50、葡萄糖20、酵母膏20、琼脂20，pH值自然。

种子培养基（g/l）：葡萄糖20、蛋白胨20、酵母膏10，pH值自然。

发酵培养基：母液7%、玉米浆33.3%、MS添加剂，pH值自然。

对照培养基（g/l）：蔗糖50、硫酸铵15、酵母膏5，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 红酵母发酵培养方法

摇瓶培养方法:将红酵母菌株（Rhodotorula sp.D）从保存培养基转接到斜面活化培养基上，生化培养箱中28℃条件下培养48 h之后，接2环于种子培养基中，28℃振荡(200 r/min)培养18 h至对数生长期，取种子培养液，接种量10%，于装液量为50 ml/250 ml三角瓶中28℃振荡(200 r/min)培养72 h。

7 L发酵罐培养方法：发酵罐中装液量5 L，接种量10%，通气量3 Lpm，温度为28℃，转速200 r/min下培养。

1000 L发酵罐培养方法：15 L种子罐装液10 L，接种量10%，通气搅拌培养18 h，然后转入装液100 L的200 L二级种子罐通气搅拌培养6 h，然后转入装液量为700 L的1000 L罐28℃通气搅拌发酵至终点。

1.2.2 培养基优化方法

利用不同的浓度母液代替发酵培养基中的蔗糖，不同浓度玉米浆代替发酵培养基中的硫酸铵和酵母膏。

1.2.3 类胡萝卜素产量测定方法

从液态发酵液中取出4 ml进行离心(3500 r/min,15 min)得到湿菌体，直接加入6 ml盐酸(3 mol/l)，室温下振荡浸泡1 h，在沸水浴中煮4 min,迅速冷却，3500 r/min离心15 min，弃上清液体，沉淀用蒸馏水洗2～3次后加入3 ml提取溶剂，室温下振荡以浸提类胡萝卜素，然后3500 r/min离心15 min，得上清液即为类胡萝卜素提取液,如细胞碎片中仍有色素，加提取溶剂进一步提取，合并提取液。将含有类胡萝卜素的提取液在紫外分光光度计中扫描，得到最大吸收波长。

将提取液适当稀释后用722型分光光度计在最大吸收波长处测定吸光度，按下式计算类胡萝卜素产量：

单位体积发酵液的类胡萝卜产量(μg/ml)=A×D×V/0.16×W。

式中：A为类胡萝卜素最大波长处的吸光度；D为色素浸提液稀释倍数；V为浸提所用溶剂的总体积(ml)；W为提取所用的发酵液体积(ml)；0.16为胡萝卜素的摩尔消光系数。

1.2.4 细胞生物量测定方法

将发酵液离心(3500 r/min)10 min，弃上清液，沉淀水洗后再次离心，所得酵母湿菌体于60℃烘干至恒重后称重。

1.2.5 残糖浓度测定

用SBA-40D生物传感分析仪测定，标准样为100 mg/dl葡萄糖。

1.2.6 粗蛋白质含量的测定

粗蛋白测定采用凯氏定氮法。

2 结果与讨论

2.1 摇瓶发酵优化

对玉米浆浓度做4个梯度来确定最适氮源浓度，红酵母的生物量，类胡萝卜素含量及产量等数据见表1。

表1 不同浓度玉米浆对红酵母D的影响

氮源是构成菌体细胞物质和代谢产物的主要成分之一，从表1可以看出当玉米浆添加量为33.3%，菌体的生物量和色素产量都达到最大，这时培养基里面的总氮含量为3.5 g/l，与对照培养基里面的氮源浓度（3.6 g/l）非常接近。当玉米浆添加量为25%时氮源的浓度过低，会导致氮源的不足，菌体生长营养不足，生物量和色素产量都会降低；当玉米浆添加量大于33.3%时氮源浓度过高，容易产生氮分解代谢产物阻遏作用，所以本研究选择玉米浆的添加量为33.3%。

对葡萄糖的浓度做8个梯度来确定最佳碳源浓度，红酵母的生物量，类胡萝卜素含量及产量等数据见表2。从表2可以看出当葡萄糖浓度为35 g/l时，菌体生物量和色素的产量都是最大，据有关文献报道，培养基的碳氮比（C/N）为4～5的时候利于红酵母菌色素的积累，此次培养的葡萄糖浓度为35～45 g/l时碳氮比接近4～5，色素产量也是最高，而葡萄糖浓度大于50 g/l，红酵母的生物量和类胡萝卜素产量开始下降，所以综合考虑选择葡萄糖的浓度为35 g/l（母液添加量7%）。此时的生物量、类胡萝卜素含量和产量分别为26.50 g/l，335.85 μg/g和8.90 mg/l。

表2 不同浓度葡萄糖对红酵母D的影响

2.2 小型发酵罐研究

在7 L发酵罐中装液5 L，以前面摇瓶优化得出的配方为发酵培养基，添加MS添加剂，在接种量为10%，转速200 r/min，通气量3 Lpm，温度28℃的条件下发酵，发酵培养数据见图1和图2。

由图1和图2可以看出，经过16 h的延滞期后，菌体生物量和色素产量开始同步增加，此时葡萄糖大量被消耗，pH值开始下降；到48 h时菌体生长速度开始减慢，葡萄糖基本消耗殆尽，pH值下降变平缓，之后开始上升；这种现象的出现跟红酵母得到代谢产物有关，这期间刚好是红酵母生长的对数期，随着菌体的快速生长，发酵液中的碳源和氮源大量的被消耗，产生某些酸性物质从而使pH值下降，而在对数生长末期或者衰亡期出现细胞自溶的现象，释放蛋白造成pH值回升；类胡萝卜素是红酵母的次生代谢产物，48 h后还在继续增加，到达72 h趋于平稳，此时菌体生物量和色素产量分别达到30.2 g/l和11.3 mg/l。过长的培养时间会增加生产成本，所以综合以上来考虑，确定发酵罐的发酵时间为72 h。

图1 7 L发酵罐OD值，生物量和残糖的变化曲线

图2 7 L发酵罐类胡萝卜素产量和pH值变化曲线

2.3 大型发酵罐研究

在1000 L发酵罐中装液量700 L，以前面摇瓶优化出的配方为发酵培养基，添加MS添加剂，通气搅拌发酵，发酵数据见图3。

图3 1000 L发酵罐OD值，残糖，pH值变化曲线

由图3可以看出，在1000 L的罐子中，延滞期比较短暂，经过8 h就开始进入对数期，此时葡萄糖大量的被消耗，红酵母迅速生长。在发酵初期，pH值下降比较缓慢，8 h开始迅速下降，到达12 h开始减缓；在41 h时生物量和色素产量都达到最大值（为42 g/l和17 mg/l），此时葡萄糖被消耗殆尽，发酵结束。相对于7 L发酵罐，1000 L发酵罐的对数期提前，且生长迅速，菌体生物量、色素产量都增大。这是因为随着发酵规模的扩大，通气量增大，比生长速率增加，酵母的生长更为迅速，发酵周期越来越短，这对于发酵来说是有利的，但是也会导致发酵液中营养物质尤其是碳源的快速消耗，造成产物产量下降。在以后的研究中，我们可以考虑对流加糖补充碳源做进一步研究。考虑到生产成本，最后确定1000 L发酵罐的下罐时间为41 h。

2.4 喷雾干燥

对1000 L发酵罐中生产的700 L发酵液进行喷雾干燥，调节进口温度为155℃，出口温度为75℃，喷雾干燥8 h后得到35 kg产品，该产品为粉红色粉末状，其中粗蛋白质含量达到31%，类胡萝卜素含量为180.4 μg/g。

3 结论

3.1 本试验研究了红酵母D(Rhodotorula sp.D)发酵条件，通过对红酵母D利用玉米浆做氮源发酵产富含类胡萝卜素功能饲料的液态发酵碳氮源进行筛选，确定了当葡萄糖含量为35 g/（l母液添加量7%），玉米浆添加量33.3%为最佳碳氮比组合，此时的菌体生物量、色素含量和色素产量分别达到26.50 g/l，335.85 μg/g 和8.90 mg/l。

3.2 在发酵罐试验中，通过对发酵罐的数据分析，得出在7 L罐中的最佳下罐时间为72 h，此时的菌体生物量、色素含量和色素产量分别为30.2 g/l，374.1 μg/g 和11.3 mg/l；1000 L发酵罐的下罐时间为41 h，此时的菌体生物量、色素含量和色素产量分别为42 g/l，404.6 μg/g 和17 mg/l。

3.3 对中试试验中生产的700 L发酵液进行喷雾干燥，进口温度155℃，出口温度75℃喷雾干燥后得到35 kg产品，性状为粉红色粉末，其中粗蛋白质含量达到31%，类胡萝卜素含量为180.4 μg/g；综合以上结果表明，控制好发酵条件，还是可以利用玉米浆做氮源来生产红酵母增色饲料的。

（参考文献19篇，刊略，需者可函索）