枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BS1发酵培养基的优化

2013-02-20陆兆新吕凤霞别小妹

饲料工业 2013年12期

■钟蔚陆兆新吕凤霞别小妹

（南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095）

芽孢杆菌类微生态制剂因其独特的芽孢存在形式，较其他种类微生态制剂具有更好的商品稳定性，成为近年来饲用微生态制剂开发的热点。许多研究人员致力于枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化，从现有文献报道来看，多数培养基成分为牛肉膏、酵母膏、蛋白胨等价格较昂贵的原料[1-5]，不适用于工业化大规模生产。而选用低成本培养基原料的研究中，多数研究人员的目标在于提高单位体积发酵液活菌数量[6-9]，对提高芽孢数量的研究较少。但从微生态制剂的角度考虑，芽孢数量较活菌数量在生产上更具实际意义。本研究对1株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BS1的发酵培养基进行了优化，以提高枯草芽孢杆菌BS1的芽孢产量并降低原料成本，得到适用于工业化生产的培养基配方。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌 BS1（Bacillus subtilis BS1）菌株，由南京农业大学酶工程研究室存留。

种子培养基：牛肉膏3 g/l、鱼粉蛋白胨10 g/l、NaCl 5 g/l，pH值7.0～7.2。

斜面及固体培养基：牛肉膏3 g/l、鱼粉蛋白胨10 g/l、NaCl 5 g/l、琼脂15～20 g/l，pH值7.0～7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 枯草芽孢杆菌（B.subtilis）BS1培养方法

菌种活化：将枯草芽孢杆菌BS1转接于斜面培养基上，37℃静置培养24 h；

种子液制备：从斜面上刮取两环活化好的菌株接种于种子培养基，37℃、180 r/min振荡培养16～20 h后使用；

发酵培养：将培养好的种子液按5%(V/V)的接种量接种于发酵培养基中，37℃、180 r/min振荡培养48 h。

1.2.2 检测方法

活菌计数方法：平板菌落计数法[10]。

芽孢计数方法：将待计数样品于80℃水浴处理15 min后,再采用平板菌落计数法计数，所得计数结果即芽孢数[11]。

芽孢转化率的计算：芽孢转化率即芽孢数占活菌数的百分比。

1.2.3 发酵培养基的设计

1.2.3.1 单因素试验

以种子培养基为出发培养基（牛肉膏3 g/l、鱼粉蛋白胨10 g/l、NaCl 5 g/l，pH值7.0）。

依次替换出发培养基中的碳源、氮源和无机盐物质，其他成分不变，发酵培养枯草芽孢杆菌BS1，测定芽孢产量与芽孢转化率，确定最佳碳源、氮源和无机盐。

1.2.3.2 正交试验

分析单因素试验结果，综合考虑芽孢产量和芽孢转化率两项指标，确定最佳碳源、氮源和无机盐。设计正交试验，研究碳源、氮源及无机盐对枯草芽孢杆菌BS1芽孢形成的影响，并进一步确定三种培养基组分间的最佳配比。

1.2.3.3 回归正交组合试验

通过回归正交组合试验，进一步考察培养基组分间的交互作用对枯草芽孢杆菌BS1芽孢产量的影响，从而进一步优化发酵培养基配方。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源对枯草芽孢杆菌BS1芽孢产量和芽孢转化率的影响

以鱼粉蛋白胨作为氮源，按3 g/l的添加量添加不同碳源，考察不同碳源对BS1菌株芽孢产量和芽孢转化率的影响，结果见图1。

图1 不同碳源对枯草芽孢杆菌BS1芽孢产量和芽孢转化率的影响

由图1可见，以麦芽浸粉作为碳源时，芽孢产量与芽孢转化率都较其他5种碳源更高，因此选择麦芽浸粉作为最佳碳源。

麦芽的主要成分为淀粉、还原糖、蔗糖、蛋白质以及粗脂肪。麦芽浸粉是将麦芽中的蛋白质酶解为小分子多肽和部分游离氨基酸而成的。淀粉是麦芽浸粉中最主要的成分，而以可溶性淀粉作为唯一碳源时，芽孢产量却非常低，这一现象表明，当淀粉与麦芽浸粉中的其他成分共同作用时，可有效促进枯草芽孢杆菌BS1芽孢的形成。以蔗糖、玉米粉为唯一碳源时效果也不如麦芽浸粉理想，可以推测，单一速效碳源或单一缓效碳源都不利于BS1芽孢的形成，速效碳源（如还原糖、蔗糖）与缓效碳源（淀粉）配合使用，较有利于提高BS1的芽孢产量。因此，在工业化生产中，如果需要进一步降低原料成本，将缓效碳源（如淀粉）与速效碳源（如葡萄糖、蔗糖）进行复配用以替代麦芽浸粉是可行的。

2.2 不同氮源对枯草芽孢杆菌BS1芽孢产量和芽孢转化率的影响

以牛肉膏作为碳源，加入10 g/l的不同氮源，考察不同氮源对BS1菌株芽孢产量和芽孢转化率的影响，结果见图2。

图2 不同氮源对枯草芽孢杆菌BS1芽孢产量和芽孢转化率的影响

由图2可见，以大豆蛋白胨为氮源时可获得相对最高的芽孢转化率，其次为鱼粉蛋白胨、黄豆粉，但黄豆粉的芽孢产量远高于大豆蛋白胨和鱼粉蛋白胨。造成这种结果的原因可能是，黄豆粉中含有的营养成分较蛋白胨更为复杂多样，有利于枯草芽孢杆菌BS1的菌体大量生长。基于我们最终的试验目的是获得较高的芽孢产量，所以选择黄豆粉作为最佳氮源。

NH4Cl和尿素作为氮源时，芽孢产量与转化率都非常低，表明以单一速效氮源作为唯一氮源既不利于BS1菌体生长，也不利于其芽孢的形成。但是，速效氮源和缓效氮源的复配，可能对菌体的生长产生正面作用，值得进一步研究。

2.3 不同无机盐对枯草芽孢杆菌BS1芽孢产量和芽孢转化率的影响

以牛肉膏作为碳源，鱼粉蛋白胨为氮源，加入5 g/l的不同无机盐，考察不同无机盐对BS1菌株芽孢产量和芽孢转化率的影响，结果见图3。

图3 不同无机盐对枯草芽孢杆菌BS1芽孢产量和芽孢转化率的影响

由图3可见，以碳酸钙作为无机盐时，枯草芽孢杆菌BS1的芽孢产量和转化率都要高于氯化钠和硫酸锰，因此确定碳酸钙为最佳无机盐。

2.4 正交试验

通过单因素试验，确定了最佳碳源、氮源和无机盐分别为麦芽浸粉、黄豆粉和碳酸钙。为了进一步提高芽孢产量，设计了L12（33）正交试验（正交试验因素水平设计见表1）以芽孢产量为指标，确定麦芽浸粉、黄豆粉和碳酸钙三者最佳配比。正交试验结果见表2，正交试验方差分析见表3。

表1 正交试验因素水平设计

表2 培养基配方正交试验结果

表3 正交试验方差分析

正交试验结果表明，在所选择的各因素中，碳酸钙（C）的极差最大，表明碳酸钙对枯草芽孢杆菌BS1芽孢产量的影响最大，其次为麦芽浸粉（A），黄豆粉（B）对芽孢产量的影响最小。方差分析结果亦显示三者对芽孢产量的影响在统计学意义上是显著的，其中碳酸钙的影响极显著。

根据正交试验的数据分析结果，最优组合应为A1B1C3，但实际所设计的正交试验结果中芽孢产量最高的组合为A1B3C3，理论最优组合与实际最优组合不吻合，说明因素间存在交互作用，且这些交互作用对芽孢产量有较大影响，因此，在后续试验中，需要进一步考察因素间的交互作用对芽孢产量的影响，进而获得更加适于枯草芽孢杆菌BS1芽孢形成的培养基配方。