壮骨颗粒对骨折愈合中HIF-1α分泌及骨痂形成影响

王波,万修阳,陈德喜

(青岛大学医学院附属青岛市海慈医院骨伤科,山东青岛 266033)

壮骨颗粒对骨折愈合中HIF-1α分泌及骨痂形成影响

王波,万修阳,陈德喜

(青岛大学医学院附属青岛市海慈医院骨伤科,山东青岛 266033)

目的探讨壮骨颗粒对动物模型骨折断端缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)分泌与骨痂形成的影响。方法32只新西兰大白兔随机分成壮骨颗粒组和对照组,各16只。建立兔左前肢桡骨骨折模型,壮骨颗粒组给予壮骨颗粒灌胃治疗,对照组给予安慰剂,分别于术后1、2、4、8周拍X线片,盲法对外骨痂和骨折线进行定量评价;取骨折处骨标本,行免疫组化染色,检测骨痂组织HIF-1α阳性强度。结果壮骨颗粒组、对照组外骨痂与骨折线评分随时间延长逐渐增加,差异有显著性(F＝555.63、458.82,P＜0.01);从第2周开始,壮骨颗粒组与对照组外骨痂与骨折线评分比较,差异有显著性(F＝6.51～134.14,P＜0.05)。骨折后第1周两组均未见HIF-1α阳性染色;骨折2周后,两组组内不同时间比较、两组间同一时间HIF-1α阳性强度比较,差异均有显著性(F＝6.76～64.93,P＜0.05)。结论壮骨颗粒可促进HIF-1α在骨痂组织中的表达,加速骨痂生成,提高骨痂质量。

骨折愈合;骨痂;缺氧诱导因子1;壮骨颗粒

骨折的愈合需要具备三方面的条件:骨折断端稳定的固定、骨折处足够量具有成骨能力的细胞(包括向成骨及成软骨方向定向分化的间充质细胞及成骨细胞、成软骨细胞)及骨折断端丰富的血运[1]。中药治疗骨折有很好的效果。本文在以往研究的基础上,探讨中药壮骨颗粒对骨折的治疗作用及其机制,以更好地指导临床。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康新西兰大白兔32只,10月龄,雌雄各半,体质量2.0～2.2 kg。壮骨颗粒(组方:补骨脂、淫羊藿、山茱萸、煅狗骨、党参、补骨脂、自然铜等,原药材购自青岛市医药公司),青岛市海慈医疗集团制剂室加工制备,每克颗粒含原生药2.9 g。

1.2 实验方法

新西兰大白兔随机分为壮骨颗粒组和对照组,每组16只,适应性喂养1周后均制备左侧桡骨中段骨折模型。骨折模型制备方法:兔前肢脱毛,耳缘静脉进行麻醉;常规消毒,铺巾,取前肢下段内侧约4 cm切口,常规切开皮肤,暴露桡骨,在桡骨旋前圆肌止点远端,用线锯造成3 mm的骨缺损[2]。冲洗,缝合皮层,骨折不固定,清洁纱布包扎伤口。术后每只兔均肌肉注射青霉素40万单位,连续注射3 d。分笼饲养,注意清洁卫生。壮骨颗粒组给予壮骨颗粒0.5 g/kg(生药)灌胃,每天3次;对照组给予安慰剂,剂量用法同壮骨颗粒组。

1.3 检测指标及方法

术后1、2、4、8周,随机从两组中各选4只大白兔进行X线摄片,采用盲法对外骨痂和骨折线进行定量评价[2-3];然后将兔处死,从骨折处取长度为1 cm的骨标本(保留骨膜组织),置于40 g/L的多聚甲醛溶液中4℃环境下固定48 h,再放入150 g/ L的EDTA溶液中脱钙2周,3 d更换脱钙液1次。脱钙后,经梯度乙醇逐级脱水后,石蜡纵向包埋,切片,厚度5μm,行免疫组化染色。显微镜下(100倍)观察,每个标本取5张切片,每张切片随机取5个视野,测定HIF-1α阳性强度,取其均值。

1.4 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计学处理,计量资料结果用±s表示,数据间比较采用析因设计的方差分析。

2 结 果

2.1 两组外骨痂与骨折线评分比较

第1周壮骨颗粒组骨痂没有形成,骨小梁不明显;对照组大量的纤维组织增生,少量骨痂生成。第2周开始,壮骨颗粒组与对照组开始出现骨痂。第4周,壮骨颗粒组骨痂量明显增多,部分动物骨折断端被骨痂完全充填。第8周壮骨颗粒组骨折断端骨折线消失,骨膜反应明显;对照组骨折断端模糊,骨膜反应密度浅淡,骨痂量少。壮骨颗粒组、对照组外骨痂与骨折线评分随时间延长逐渐增加,差异有显著性(F＝555.63、458.82,P＜0.01)。从第2周开始,壮骨颗粒组与对照组外骨痂和骨折线评分比较,差异有显著性(F＝6.51～134.14,P＜0.05)。见表1。

2.2 两组HIF-1α阳性强度比较

骨折后第1周两组均未见HIF-1α阳性染色;骨折后2周,壮骨颗粒组与对照组骨折断端、骨外膜下及周围软组织形成的血肿内有大量的细胞增殖分化,这些细胞间质中HIF-1α染色阳性;骨折后4周,骨痂中成骨细胞着色较深,壮骨颗粒组较对照组HIF-1α阳性表达数目多;骨折后8周,两组中成骨细胞成熟,骨小梁周围HIF-1α表达较弱。两组组内不同时间比较、两组间同一时间比较,HIF-1α阳性强度差异有显著性(F＝6.76～64.93,P＜0.05)。见表2。

3 讨 论

近年来出现了许多可以促进骨折愈合的方法,其机制为促进细胞活性、促进骨痂生成、调节骨细胞基因序列的表达、干预骨生长因子的生成等[4-7]。中药可在骨折愈合不同时期发挥修复作用[2]。壮骨颗粒以中医“肾主骨”、“补先后天”理论为原则组方而成,主要由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、党参、补骨脂及自然铜等药组成。现代研究表明,按骨折愈合过程,在血肿机化期,煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、党参、补骨脂等活血化瘀药可以促进微循环代谢,增加骨折断端局部血运,清除血凝块及代谢产物,起到消肿止痛、促进骨细胞生成作用[8-9]。

表1 两组不同时间外骨痂与骨折线评分比较(n＝4,±s)

__组__别______1周2周4周8周对 照 组0.835±0.754 6.551±1.047 18.505±1.374 25.785±1.023壮骨颗粒组2.831±0.980 9.168±1.169 21.335±2.064 35.465±1.564

表2 两组术后不同时间骨痂标本中HIF-1α阳性强度比较(n＝20,±s)

____组__别___________________________________________________ ________2周4周8周对 照 组2.67±0.23 3.12±0.37 2.01±0.05 __壮骨颗粒组____3.56±0.09____4.23±0.6____________________ 7 2.11±0.07

HIF-1是体内细胞在低氧环境中产生的一种结合DNA蛋白质因子,参与对低氧反应基因的调控,从而使人体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应。已有研究表明,低氧-HIFα通路调节骨发育与骨形成过程,在骨和关节形成、发育进程中,HIF-1α表达具有与骨生长进程相关联的显著时空特征[10-13]。

本文结果显示,骨折2周后,壮骨颗粒组与对照组组内不同时间比较、两组间同一时间比较,HIF-1α阳性强度差异均有显著性。提示壮骨颗粒可促进兔骨折愈合并促进成骨活跃,提高骨折的愈合质量。其作用机制可能与调节骨代谢相关因子、促进骨折局部骨痂形成,调节血清微量元素等有关。

[1]罗涛,齐进,周琦,等.骨折愈合过程中低氧诱导因子-1α的表达及其调节作用[J].上海交通大学学报,2009,8:902-908.

[2]田青山,隋国兴,栗坤.十味接骨药对家兔骨折骨细胞生长机理的实验研究[J].中国实用医药,2010(4):14-17.

[3]郭沈波,杨志宏,王守彪,等.壮骨液治疗骨缺损相关血生化学指标的检测[J].青岛大学医学院学报,2004,40(4):344-345, 348.

[4]潘晓华.骨折愈合影像定量评价的研究[D].华中科技大学, 2009.

[5]黄有荣,高冠群,杨丽平,等.白脉软膏对家兔桡骨骨折愈合过程及骨痂骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子水平的影响[J].中华临床医师杂志:电子版,2012,13(6):112-114.

[6]张纲,李焰,谭颖徽.细胞生长因子在骨折愈合中的作用研究进展[J].重庆医学,2008,37(2):196-197.

[7]孙炳烈,徐今宇,赵然,等.

平乐内服接骨丹对骨折愈合作用的实验研究[J].骨伤科通讯,1985,7(4):1-13.

[8]刘钟华,杨世荣,回春.中药促进骨折愈合的实验研究概况[J].长春中医学院学报,2004,20(2):63-65.

[9]符诗聪,杜宁,史炜镔,等.丹参有效部位对骨折愈合影响的生物力学实验研究[J].中国中西医结合杂志,1999,19(2):106.

[10]詹金华,陈德喜,万修阳,等.壮骨颗粒对骨折愈合的影响[J].齐鲁医学杂志,2010,25(4):336-337,340.

[11]朱勋兵,邓廉夫.低氧诱导因子-1α在小鼠椎体发育中的表达及其意义[J].中华医学杂志,2006,86(23):1638-1643.

[12]任步方,邓廉夫,王君,等.低氧环境对小鼠未成熟关节透明软骨细胞培养的影响[J].中华骨科杂志,2008,28(1):56-62.

[13]REN B F,DENG L F,WANG J,et al.Hypoxia regulation of facilitated glucose transporter-1 and glucose transporter-3 in mouse chondrocytes mediated by HIF-1 alpha[J].Joint Bone Spine,2008,75(2):176-181.

(本文编辑 黄建乡)

THE EFFECT OF ZHUANGGU GRANULA ON SECRETION OF HIF-1αAND CALLUS FORMATION IN FRACTURE HEALING

WANG Bo,WAN Xiuyang,CHEN Dexi (Department of Orthopedics,Qingdao Hiser Hospital,Qingdao 266033,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Zhuanggu granula on secretion of HIF-1αand callus formation in animal model with fracture.MethodsA total of 32 New Zealand rabbits were equally randomized to two groups.A model of left radius fracture was created in rabbits.Intragastric administration of Zhunggu granula was given to rabbits in the Zhunggu granula group,and to those in the control,placebo was offered.X-ray films were taken 1,2,4 and 8 weeks after surgery.The blind method was used to quantitatively assess external callus and fracture line.Bone samples from the fractured part were taken and stained by immunohistochemisty to determine positive HIF-1αin bony callus.ResultsThe score of external callus and fracture line in both groups was increased along with the extension of duration,the different was significant.The differences of scores of external callus and fracture line between Zhuanggu granula and control group were significant beginning from the second week(F＝6.51－134.14,P＜0.05).No positive staining of HIF-1αwas found on the first week of fracture;after two weeks,the positive expression of HIF-1αof different time points in the same group,and that of the same time point between the two groups were significant(F＝6.76－64.93,P＜0.05).ConclusionZhuanggu granula can promote the secretion of HIF-1αin bone callus,and accelerate its formation and raise its quality.

fracture healing;bony callus;hypoxia-inducible factor 1;Zhuanggu granula

R683.41

A

1008-0341(2013)04-0359-03

10.11712/qlyx201304026

2013-01-04;

2013-06-06

青岛市科技发展计划(07-2-1-20-nsh)

王波(1979-),男,在读硕士研究生。

陈德喜(1959-),男,教授,硕士生导师。