塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖及干性标记物CD133表达的影响

刘丽,付亚磊,沈方臻,宋金霞,姚如永

(1 青岛大学医学院附属医院肿瘤科,山东青岛 266003; 2 青岛市妇女儿童医院乳腺科; 3 青岛大学医学院附属医院中心实验室)

塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖及干性标记物CD133表达的影响

刘丽1,付亚磊2,沈方臻1,宋金霞1,姚如永3

(1 青岛大学医学院附属医院肿瘤科,山东青岛 266003; 2 青岛市妇女儿童医院乳腺科; 3 青岛大学医学院附属医院中心实验室)

目的观察环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖及肿瘤干细胞标记物CD133表达的影响。方法取对数生长期的SW1990细胞,分别加入不同浓度的单药吉西他滨、单药塞来昔布、塞来昔布联合吉西他滨进行培养,观察SW1990细胞增殖抑制情况及CD133m RNA、表面分子CD133表达变化。结果不同浓度塞来昔布与吉西他滨(0.500μmol/L)联合应用,对SW1990细胞的增殖抑制作用更为明显,与0.500μmol/L吉西他滨组比较,差异均有显著性(F＝339.28～967.22,q＝4.48～36.76,P＜0.05),与对应剂量的塞来昔布组比较,差异亦均有显著性(q＝16.24～66.23,P＜0.05)。不同浓度塞来昔布组胰腺癌细胞株SW1990 CD133m RNA的表达较对照组明显下调(F＝51.84～625.80,q＝14.39～45.03,P＜0.05),联合应用塞来昔布与吉西他滨(0.500μmol/L)时,其下调作用较各浓度单药塞来昔布减弱,差异有显著性(q＝2.85～7.75,P＜0.05)。结论塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990的增殖有抑制作用,且与吉西他滨有协同作用;塞来昔布可显著下调SW1990细胞株干细胞表面标记物CD133m RNA的表达。

胰腺肿瘤;肿瘤干细胞;塞来昔布;吉西他滨;CD133

胰腺癌是一种预后极差的恶性肿瘤,其手术切除率低且术后容易复发和转移,对放、化疗均不敏感,即使早期诊断,病人5年的生存率不到5%,中位生存期仅为4～6个月[1]。胰腺癌一线化疗药物吉西他滨在延长病人生存期方面取得了一些进展,但疗效仍不能令人满意。肿瘤干细胞(CSCs)理论是近年肿瘤研究的热点,该理论认为,肿瘤内部存在一小部分具有干细胞特性的细胞,即CSCs,它具备无限增殖、多向分化、自我更新和极强的成瘤能力,形成肿瘤并维持肿瘤的生长,且对常规的放化疗更不敏感,其可能是肿瘤转移、复发及耐药的根源[2]。塞来昔布作为一种新型环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂,具有抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡的作用。研究显示,塞来昔布具有抑制结直肠癌、胃癌、胰腺癌等胃肠道肿瘤的发生、发展和转移以及血管形成的作用[3]。本研究通过观察塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖及肿瘤干细胞标记物CD133表达的影响,旨在探讨非甾体类抗炎药物的抗肿瘤机制,为胰腺癌的靶向治疗提供新的突破点。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人胰腺癌细胞株SW1990由我院中心实验室提供,L15培养液购自上海吉诺生物公司,胎牛血清购自上海北诺生物科技有限公司,四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司,塞来昔布购自南京德宝生化器材有限公司,PT-PCR试剂盒、Premix Ex Tap及Trizol提取液购自宝生工程(大连)有限公司,鼠抗人CDl33-PE及鼠抗人IgG-PE购自上海鑫乐生物技术有限公司,PCR引物购自上海生工生物工程有限公司,吉西他滨购自美国Lily公司。

1.2 细胞培养

胰腺癌细胞株SW1990以含体积分数0.10胎牛血清的L15培养液在37℃、含体积分数0.05的CO2条件下培养,细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时,用含EDTA的胰蛋白酶消化、传代。

1.3 SW1990细胞增殖抑制率计算

取对数生长期的SW1990细胞,制成单细胞悬液,接种至96孔板,每孔5×104个细胞,待细胞贴壁后分为3组,塞来昔布组分别加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L的塞来昔布,吉西他滨组分别加入0.005、0.050、0.500、5.000、50.000μmol/L的吉西他滨,联合组分别加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L的塞来昔布联合0.500μmol/ L的吉西他滨,每组5个复孔,各组均以不加药物的细胞作为对照(对照组),同时设空白对照组。各组培养48 h后,每孔加MTT溶液20μL,继续培养4 h。吸去培养液,每孔加DMSO溶液150μL,振荡混匀,用酶标仪于波长490 nm处检测吸光度值(A值),计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率＝1－(实验组A值－空白对照组A值)∕(对照组A值－空白对照组A值)×100%。

1.4 SW1990细胞CD133mRNA检测

取贴壁生长至70%～80%融合、状态良好的细胞分3个实验组,其中一组加入0.500μmol/L的吉西他滨,另一组分别加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞来昔布,最后一组分别加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L的塞来昔布同时联合0.500μmol/L的吉西他滨。另设不加药物的细胞作为对照(对照组)。各组培养48 h。另取贴壁生长至70%～80%融合、状态良好的细胞分3个组,均加入50.00μmol/L塞来昔布,培养时间分别为24、36、72 h,设不加药物的细胞为对照组。提取以上各组细胞的总RNA,进行PT-PCR反应合成cDNA。PROM1(CD133)基因,预期扩增产物为123 bp,上游引物:5′-AAGGAGTCGGAAACTGGCAGA-3′,下游引物:5′-TCTGTGAACGCCTTGTCCTTG-3′;扩增内参照GAPDH,预期扩增片段长135 bp,上游引物:5′-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3′,下游引物:5′-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3′。PCR反应条件:95℃预变性5 min、98℃变性10 s、58℃退火(GAPDH 60℃)30 s、72℃延伸10 min,循环35次(GAPDH 30次)。将PCR扩增反应产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳,并使用凝胶成像扫描系统分析,灰度值即代表目的基因CD133的相对含量,取与其对应的内参照GAPDH灰度值之比进行分析。

1.5 流式细胞术检测表面分子CD133的表达率

取贴壁生长至70%～80%融合、状态良好的细胞分3个实验组,其中一组加入0.500μmol/L的吉西他滨,另一组分别加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞来昔布,最后一组分别加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L的塞来昔布同时联合0.500μmol/L的吉西他滨,另设不加药物的细胞作为对照(对照组)。培养48 h,胰酶消化,制成浓度为1×1010/L的单细胞悬液,加入鼠抗人CD133-PE (1∶20),或者同型对照抗体鼠抗人IgG-PE(1∶10),4℃孵育30 min,PBS洗脱未结合及非特异性结合抗体,30 min内上机检测。

1.6 统计学方法

采用PPMS 1.5[4]统计软件进行统计处理,实验结果以±s,多个样本均数比较采用单因素方差分析,两样本均数比较采用独立样本t检验,以P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 吉西他滨与塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖的影响

随着吉西他滨药物浓度增大,细胞增殖抑制率明显升高,差异有显著性(F＝1 058.75,q＝9.03～76.41,P＜0.05);随着塞来昔布浓度的增加,细胞增殖抑制率明显升高,差异有显著性(F＝527.42,q＝9.23～58.06,P＜0.05)。不同浓度塞来昔布与吉西他滨(0.500μmol/L)联合应用对SW1990细胞的增殖抑制作用更为明显,与0.500μmol/L吉西他滨组比较,差异均有显著意义(F＝339.28～967.22,q＝4.48～36.76,P＜0.05),与对应剂量的塞来昔布组比较,差异亦均有统计学意义(q＝16.24～66.23, P＜0.05)。见表1。

表1 各组SW1990细胞株增殖抑制率比较(±s)

注:∗0.050μmol/L的吉西他滨＋不同浓度塞来昔布。

____分组_____药物浓度(c/μmol·L－1)细胞增殖抑制率(χ/%)吉西他滨组 0.005 15.76±1.90 0.050 24.50±2.38 0.500 48.64±1.11 5.000 73.78±1.76 50.000 89.69±3.13塞来昔布组 6.25 8.48±0.29 12.50 18.48±0.96 25.00 31.47±1.79 50.00 47.86±3.27 100.00 71.38±3.80两者联合组∗6.25 53.12±4.15 12.50 59.38±2.25 25.00 67.46±0.95 50.00 80.86±1.32 _______________________________________________________________ 100.00 89.38±1.66

2.2 吉西他滨与塞来昔布对胰腺癌细胞株SW-1990 CD133m RNA表达的影响

对照组胰腺癌细胞株SW1990 CD133mRNA表达为1.02±0.06,加入0.500μmol/L吉西他滨组为1.167±0.015,两组比较差异有显著性(t＝－3.97, P＜0.05)。12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞来昔布组胰腺癌细胞株SW1990 CD133m RNA表达分别为0.76±0.02、0.58±0.09、0.39±0.01、0.15± 0,04,较对照组表达明显下调(F＝51.84～625.80, q＝14.39～45.03,P＜0.05);且随浓度升高下调作用愈明显,差异有显著意义(F＝130.16,q＝7.86～26.62,P＜0.05)。分别加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞来昔布联合0.500μmol/L吉西他滨组胰腺癌细胞株SW1990 CD133m RNA表达分别为0.90±0.03、0.66±0.01、0.48±0.02、0.22± 0.02,其下调作用较各浓度单药塞来昔布减弱,差异有显著性(q＝2.85～7.75,P＜0.05)。固定浓度塞来昔布(50.00μmol/L)分别作用于SW1990细胞0、24、36、72 h后,SW1990 CD133m RNA表达分别为1.02±0.06、0.89±0.05、0.74±0.06、0.42±0.04,各时间点相比较,差异有显著意义(F＝118.16,q＝5.47～25.24,P＜0.05)。

2.3 吉西他滨与塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990表面分子CD133表达的影响

对照组、单药吉西他滨组、不同浓度单药塞来昔布组及不同浓度塞来昔布联合吉西他滨组在药物作用48 h后,对照组SW1990表面分子CD133表达率为(15.33±0.91)%,加入0.500μmol/L吉西他滨组为(18.34±1.25)%,较对照组表达明显升高,差异有显著性(t＝－3.38,P＜0.05)。加入12.50、25.00、50.00、100.00μmol/L塞来昔布组SW1990表面分子CD133表达率依次为(9.51±0.61)%、(8.46±0.20)%、(6.36±0.12)%、(4.47±0.15)%,较对照组表达明显下调(F＝111.52～639.60,q＝19.79～45.01,P＜0.05),且随浓度升高下调作用愈明显,差异有显著性(F＝223.94,q＝7.01～33.64, P＜0.05)。加入12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L塞来昔布联合0.500μmol/L吉西他滨组SW1990表面分子CD133表达率依次为(10.51±0.32)%、(9.09±0.18)%、(7.39±0.20)%、(5.08±0.15)%,其下调作用较各浓度单药塞来昔布减弱,差异有统计学差异(q＝2.57～4.24,P＜0.05)。

3 讨 论

胰腺癌是一种发病隐匿、进展快、预后差的消化系统肿瘤,发病率逐年升高,对放化疗不敏感,病死率高,数十年来胰腺癌相关的基础与临床研究一直为学术界的热点[1,5-6]。近年来,CSC理论日益受到重视,CSC为具有自我更新和分化潜能的肿瘤细胞,与非CSC细胞相比,CSC对放、化疗不敏感[7],具有较强的致瘤能力,为胰腺癌放化疗抵抗及复发的重要原因。LEE等[8]应用流式细胞分选技术从胰腺癌组织中分选出表型为CD＋44CD＋24ESA＋的细胞亚群,虽然该细胞亚群只占癌细胞总数的0.2%～0.8%,却具有极高的致瘤性。LI等[9]通过异种移植模型培养人胰腺癌原代细胞,成功分离出以CD＋44CD＋24ESA＋为标记的人胰腺癌CSC,证实该亚群的细胞具有多向分化和高致瘤的特征。最初人们在脑瘤和结肠癌中发现了具有CD133表型的CSC,后来HERMANN等[10]在胰腺癌组织及细胞株中也分选出了同样具有极强的致瘤性的CD＋133亚群细胞,该CD＋133细胞在受到吉西他滨作用后数量激增。LEE等[8]的研究也发现了相似现象,移植人胰腺癌的免疫缺陷小鼠,其移植瘤经放射线照射和吉西他滨作用后,表达CD＋44CD＋24ESA＋癌细胞数量显著增加。

近年来大量的研究结果显示,非甾体类抗炎药(NSADs)具有预防和抑制人类肿瘤特别是消化道肿瘤的作用,其作用主要与COX-2的活性有关[11]。塞来昔布可高选择性抑制COX-2的活性,由于其靶向性强、副作用小,已在多种实体肿瘤包括胰腺癌的预防和治疗中发挥作用[3]。有研究显示,COX-2在胰腺癌组织中的表达显著高于正常胰腺组织[11],提示以COX-2为靶标,有可能成为治疗和预防胰腺癌的新途径。研究显示,塞来昔布可增强胰腺癌放疗敏感性[12]及对吉西他滨的化疗敏感性[11],其机制涉及诱导细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管生成及肿瘤侵袭等多个方面[13-14]。

本研究将吉西他滨和塞来昔布联合作用于胰腺癌细胞株SW1990,结果显示,单用吉西他滨或塞来昔布对细胞的增殖抑制作用均呈明显的量效关系,当塞来昔布(50.00μmol/L)与吉西他滨(0.500μmol/L)联合应用时,对SW1990细胞的抑制率明显提高,表明塞来昔布对吉西他滨抑制SW1990细胞的增殖有协同作用。PCR技术检测结果显示,塞来昔布可下调CD133m RNA的表达,且随浓度增加其下调作用愈明显,而单药吉西他滨作用于细胞株,其CD133m RNA的表达较对照组高,与HREMANN等[10]的研究结果一致。当塞来昔布与吉西他滨联合应用时,SW1990表面分子CD133的表达率亦降低,但其下调趋势无单药塞来昔布明显,表明吉西他滨对塞来昔布下调SW1990表面分子CD133的表达无协同作用。单药塞来昔布作用于细胞时,随时间的延长, CD133m RNA的表达率也呈明显下降趋势。流式细胞术检测从CD133表面分子水平上显示了与PCR相似的结果。

本研究结果显示,CD133标记的CSC与COX-2抑制剂之间存在着某种关联,即COX-2抑制剂可能通过某种通路来降低CD133基因的表达,既然CD133是CSC的标记物,那么也就是说COX-2抑制剂可能通过某种途径抑制CSC的增殖。将CD133分子标记CSC从实体瘤分离,那么靶向CD133分子本身就可能成为治疗CSC的靶点。本研究结果显示,塞来昔布可下调SW1990表面分子CD133的表达,且此下调作用呈时间和剂量依赖性。最近的一项研究显示,CD133阴性的细胞存在G1期阻滞[15],很多研究也显示,塞来昔布能引起细胞周期阻滞[11,16-17],因此有可能塞来昔布引起CD133下调,导致细胞周期阻滞,CD133阳性的细胞变成CD133阴性的细胞,诱导细胞分化。随着对CD133分子作用机制及信号转导通路研究的不断深入,胰腺癌CSC将成为胰腺癌治疗的新的靶点,为胰腺癌的治疗带来新的希望。

[1]JEMAL A,SIEGEL R,WARD E,et al.Cancer statistics 2008[J].CA Cancer J Clin,2008,58(2):71-96.

[2]杜志勇,韩宝三,彭承宏,等.胰腺癌干细胞研究进展[J].中华胰腺病杂志,2011,22(2):141-144.

[3]易芳,许新华.塞来昔布在肿瘤防治中的研究进展[J].临床肿瘤学志,2007,12(4):316-318.

[4]周晓彬,张建.医学统计软件PPMS 1.5的应用举例[J].齐鲁医学杂志,2011,26(6):502-505.

[6]于层,于文娟,李玉军,等.β2-ADR27位点基因多态性与胰腺癌相关性[J].齐鲁医学杂志,2012,27(4):289-294.

[7]刘静,纪新强,赵乐,等.卵巢癌肿瘤干细胞对顺铂和盐霉素的药物敏感性[J].齐鲁医学杂志,2012,27(3):193-195.

[8]LEE C J,DOSCH J,SIMEONE D M.Pancreatic cancer stem cells[J].J Clin Oncol,2008,26(17):2806-2812.

[9]LI C,HEIDT D G,DALERBA P,et al.Identification of pancreatic cancer stem cells[J].Cancer Res,2007,67(3):1030-1037.

[10]HERMANN P C,HUBER S L,HERRLER T,et al.Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer[J].Cell Stem Cell,2007,1(3):313-323.

[11]徐刚,吴恺,王兴鹏,等.塞来昔布与吉西他滨合用对胰腺癌的抑制作用及其机制[J].中华医学杂志,2005,85(14):986-991.

[12]徐刚,王兴鹏,赵国旗,等.塞来昔布对胰腺癌的放疗增敏作用及其机制研究[J].中华消化杂志,2006,26(11):753-757.

[13]王兴鹏,徐选福,吴凯,等.环氧化酶2对胰腺癌细胞凋亡的调节作用及其机制[J].中华消化杂志,2002,22(8):459-462.

[14]王兴鹏,斜传高,吴凯,等.环氧化酶2对胰腺癌新生血管生成的调节作用及其机制[J].中华肝胆外科杂志,2003,8(9): 489-491.

[15]TODARO M,ALEA M P,DI STEFANO A B,et al.Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4[J].Cell Stem Cell,2007,1(4): 389-402.

[16]CHENG J,IMANISHI H,LIU W,et al.Involvement of cell cycle regulatory proteins and MAP kinase signaling pathway in growth inhibition and cell cycle arrest by a selective cyclooxygenase-2 inhibitor,etodolac,in human hepatocellular carcinoma cell lines[J].Cancer Sci,2004,95(8):666-673.

[17]YIP-SCHNEIDER M T,SWEEMEY C J,JUNG S H,et al.Cell cycle effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and enhance growth inhibition in combination with gemcitabine in pancreatic carcinoma cells[J].J Pharmacol Exp Ther,2001, 298(3):976-985.

(本文编辑 厉建强)

THE INFLUENCE OF CELECOXIB ON PROLIFERATION OF PANCREATIC CANCER CELL LINE SW1990 AND EXPRESSION OF STEM CELL MARKER CD133

LIU Li,FU Yalei,SHEN Fangzhen,SONG Jinxia,YAO Ruyong (Department of Onco-logy,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo observe the effect of cyclooxygenase-2(COX-2)selective inhibitor celecoxib on pancreatic cancer cell line SW1990 proliferation and stem cell marker CD133expression.MethodsThe SW1990 cells in logarithmic growth phase were cultured with different concentrations of gemcitabine,celecoxib and celecoxib combined with gemcitabine,respectively.The suppression of SW1990 proliferation,and m RNA of CD133were observed.ResultsIn combined celecoxib with gemcitabine group,the proliferation of SW1990 cells was more obvious as compared with gemcitabine group(0.500μmol/L),the difference between the two groups were significant(F＝339.28－967.22;q＝4.48－36.76;P＜0.05),the difference was also significant as compared with celecoxib group of corresponding dose(q＝16.24－66.23,P＜0.05).The expression of SW1990 CD133m RNA in celecoxib group was lower than that in the control(F＝51.84－625.80;q＝14.39－45.03;P＜0.05),in combined group,its down-regulated action was weaker than that in different-dose celecoxib groups,the differences being statistically significant(q＝2.85－7.75,P＜0.05).ConclusionCelecoxib inhibits the proliferation of SW1990,and has a joint action with gemcitabine.Celecoxib can dramatically down-regulate the expression of stem cell surface marker CD133m RNA.

pancreatic neoplasms;tumor stem cells;celecoxib;gemcitabine;CD133

R735.9

A

1008-0341(2013)04-0317-04

10.11712/qlyx201304012

2012-12-27;

2013-04-27

刘丽(1986-),女,硕士研究生。

沈方臻(1962-),女,硕士,主任医师,硕士生导师。