大气压冷等离子体射流诱导乳癌细胞凋亡研究

丁威利,隋爱华,刘世海,刘相萍,王静,王海波

(青岛大学医学院附属医院乳腺中心,山东青岛 266003)

大气压冷等离子体射流诱导乳癌细胞凋亡研究

丁威利,隋爱华,刘世海,刘相萍,王静,王海波

(青岛大学医学院附属医院乳腺中心,山东青岛 266003)

目的研究大气压冷等离子体射流对乳癌细胞系MDA-MB-468细胞的凋亡诱导作用。方法采用自行研制的大气压冷等离子体射流发生装置,处理MDA-MB-468细胞。大气压冷等离子体射流处理时间分别为10、30、60和90 s,以不处理者为空白对照组,以单纯气流处理90 s者为实验对照组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖抑制率,二脒基苯基吲哚(DAPI)染色检测各组细胞的核形态变化,荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)测定各组细胞Bax和Bcl-2 mRNA的表达变化。结果大气压冷等离子体射流可明显抑制细胞的增殖,且有明显的剂量依赖性(F＝22.4、42.3,P＜0.01),而单纯气流对MDA-MB-468细胞无明显影响。经大气压冷等离子体射流处理后细胞出现核固缩及核碎裂。大气压冷等离子体射流作用后细胞Bax的表达上调,Bcl-2的表达下调(F＝32.3、12.4,P＜0.05)。结论大气压冷等离子体射流对MDA-MB-468细胞有增殖抑制作用,可能与Bax表达上调及Bcl-2表达下调诱导细胞凋亡有关。

大气压冷等离子体射流;乳腺肿瘤;细胞凋亡;基因,bcl-2;bcl-2相关X蛋白质

目前乳癌治疗的主要方式有手术、放疗、化疗以及生物靶向治疗等。这些治疗方式在治疗疾病的同时会给病人带来新的创伤与副作用,创伤副作用小的治疗方式依然处于探索阶段。大气压冷等离子体由于具有高效且作用温度低的特点,逐渐在生物学领域得到应用,尤其近年来在癌症治疗的基础研究方面逐渐为人们所重视[1-2]。大气压冷等离子体射流是由电离气流产生,射流作用在人体不会造成明显的疼痛感,对人体的远期不良影响也未见报道。本文主要研究大气压冷等离子体射流对乳癌细胞增殖的抑制作用,并初步探讨其诱导乳癌细胞凋亡的作用机制,为其应用于乳癌治疗提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳癌细胞系(MDA-MB-468),购自上海细胞库。L-15培养液及四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂购自美国Sigma公司,胰蛋白酶购自Amresco公司,胎牛血清购自Hyolone公司,Trizol试剂、反转录试剂盒及荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)试剂盒均购自TAKARA公司。

1.2 大气压冷等离子体射流装置结构

大气压冷等离子体射流装置结构见图1。放电管由单层陶瓷管构成,陶瓷管长60 mm,内、外径分别为3、6 mm。陶瓷管轴心位置置入长30 mm、直径1 mm的铜电极,铜电极上端接电源高压端,下端在陶瓷管内,距离陶瓷管下端口15 mm。在陶瓷管下部端口处,缠绕接地铜线电极。放电电源(南京苏曼电子有限公司,CTP 200K)的中心频率为35 k Hz,可调频率范围为20～45 k Hz,最大输出电压为30 k V,最大输出功率为500 W。放电电压由Tektronix P6015A高压探头测量,探头输出电压馈入Tektronix 3052B数字荧光示波器。氩气、氧气由陶瓷管上部馈入,纯度分别为99.5%、99.995%。气体流量由气体浮子流量计(大连通产仪表有限公司, TCG 800)测量,氩气、氧气的标定流量量程分别为200、4 L/h。大气压冷等离子体射流的放电处理参数如下:电源电压6 k V,频率30 k Hz,氩气与氧气的流量分别为2 L/min与0.02 L/min。喷嘴和96孔板的距离为10 mm。

1.3 细胞培养与传代

MDA-MB-468细胞生长于含体积分数0.10胎牛血清的L-15培养液中,置于37℃、体积分数0.05 CO2孵箱中培养。每日观察细胞生长情况,定期换液。细胞长成单层后,以2.5 g/L胰蛋白酶＋0.2 g/ L的EDTA消化传代。

1.4 实验分组与处理

实验共分为6个组。空白对照组(不处理)、实验对照组(单纯气流处理90 s)、实验1组(大气压冷等离子体射流处理10 s)、实验2组(大气压冷等离子体射流处理30 s)、实验3组(大气压冷等离子体射流处理60 s)、实验4组(大气压冷等离子体射流处理90 s)。

1.5 MTT法检测细胞增殖抑制率

取对数生长期的MDA-MB-468细胞,每孔接种10 000个细胞于96孔板上,设6个复孔。24 h后将孔内培养液换成40μL PBS,分组对细胞进行处理。待等离子体处理结束后离心96孔板并将PBS吸出换成新鲜培养液。每孔分别于处理结束24、48 h后,加入5 g/L MTT 10μL,继续孵育4 h,小心弃掉上清液,每孔加入DMSO 150μL,在振荡器上振荡10 min后,酶标分析仪检测波长490 nm处的吸光度(A)值。计算细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率(%)＝(对照组A值－实验组A值)/对照组A值×100%。

1.6 二脒基苯基吲哚(DAPI)染色

同上方法分组处理细胞。照射结束48 h后终止培养,离心去上清液后立即用预冷的甲醇固定, PBS液冲洗并离心后弃去上清液,滴加DAPI染液,－20℃避光孵育15 min,PBS液冲洗3次。每孔样品随机选取视野,倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.7 FQ-PCR检测Bax和Bcl-2的表达

同上方法分组处理细胞。照射结束48 h后终止培养,使用Trizol试剂提取总RNA,紫外线分光光度计测定波长260、280 nm处的A值,计算A260/ A280。取1μg总RNA按照逆转录试剂盒说明书进行反转录,反应总体积20μL;取2μL cDNA样本进行PCR扩增。引物序列见表1。PCR反应条件: 95℃预变性30 s;95℃5 s、60℃30 s,40个循环; 95℃1 min,40℃1 min,60℃15 s。扩增完后进行融解曲线分析,观察结果并用20 g/L琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。PCR反应曲线得到CT值,采用2－△△CT方法计算相对定量结果。

1.8 数据处理和统计分析

采用SPSS 11.5软件进行统计学处理。所得数据以均数±标准差表示,多组比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1 MTT检测

各实验组细胞的增殖抑制率随照射时间延长而增高,均明显高于实验对照组和空白对照组(F＝22.4、42.3,P＜0.01),而实验对照组与空白对照组比较无统计学意义(P＞0.05)。同时各实验组细胞增殖抑制率也随照射后培养时间延长而增高(t＝3.2～30.1,P＜0.01)。见表2。

2.2 形态学观察

在空白对照组与实验对照组细胞中可偶见核分裂象,但未见明显的核固缩,而各实验组的细胞中均可见明显核固缩及核碎裂,碎裂的细胞核呈亮蓝色荧光。随照射时间延长,细胞发生核固缩及核碎裂的细胞比例有增高的趋势。见图2。

2.3 FQ-PCR检测

提取各组的总RNA,检测其A260/A280比值均在1.8～2.0范围内。实验2、4组Bax和Bcl-2的表达与实验对照组和空白对照组相比均有统计学意义(F＝32.3、12.4,P＜0.01),而实验对照组与空白对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表2 大气压冷等离子体射流对MDA-MB-468细胞增殖抑制率的影响(n＝6,χ/%,±s)

____组__别____________________________________________________ ___________24 h 48 h空白对照组0.33±0.95 0.53±0.38实验对照组1.41±1.34 3.66±9.66实验1组9.65±2.31 14.72±3.12实验2组15.70±1.49 36.31±3.10实验3组21.74±2.26 53.27±1.76 __实验4组______29.29±1.87______________________________ ___57.21±1.28

表3 各组MDA-MB-468细胞中Bax和Bcl-2 mRNA的表达比较(n＝6,±s)

____组__别_____________Bax Bcl-2空白对照组1 1实验对照组1.003±0.176 1.010±0.044实验2组1.385±0.196 0.807±0.058 __实验4组______1.736±0.003______________________________ _0.731±0.066

3 讨 论

现有的肿瘤治疗方式不可避免会给病人带来新的创伤与副作用,目前还没有更好的治疗选择。大气压冷等离子体射流装置产生的射流温度低,人手指触及射流仅可感觉到轻微气体吹动,没有任何热或电击等不适感。一些基础研究认为大气压冷等离子体射流可能成为一种新的癌症治疗方式,其远期不良影响未见报道[2]。

目前的研究已表明,大气压冷等离子体射流对Hep G2、He La等细胞有灭活作用,其灭活机制与细胞凋亡有关[3]。但在乳癌细胞中灭活机制研究未见报道。本实验结果证实,在体外条件下,电离单纯气流形成的大气压冷等离子体射流对MDA-MB-468细胞具有抗增殖和诱导细胞凋亡的能力,并且随着照射时间的增加,其抑制作用也增强,而单纯气流对MDA-MB-468细胞无明显影响。这为等离子体的生物应用研究开辟了新的思路。

细胞凋亡是细胞为维持内环境稳定,由基因调控的一种自主有序的死亡过程。许多生物及化学物质诱导细胞凋亡时都伴有肿瘤细胞Bcl-2和Bax基因表达水平的改变,Bcl-2和Bax是一组与凋亡相关的拮抗基因[4]。促进凋亡和抑制凋亡的蛋白在生理情况下维持动态平衡。但该平衡可能会在细胞受到有效刺激时被打破,从而影响细胞凋亡。本研究的DAPI染色结果显示,大气压冷等离子体射流能有效诱导细胞凋亡,而单纯气流则无凋亡诱导作用。FQ-PCR结果表明,大气压冷等离子体射流可诱导乳癌细胞凋亡,而Bax与Bcl-2基因可能是其起主要作用的靶点。

目前有研究证实,大气压冷等离子体射流还具有灭菌消毒、促进切口愈合、止血的作用[5-7]。这将为现有临床治疗过程中可能出现的切口感染、术中出血等问题提供新的解决方式。同时,许多新型的等离子体装置正在不断地改进结构及功能,以适应在临床上的应用。但是这些研究多着重于研究新型的等离子体装置,处理对象多是细菌、化学材料等,而且国内外对等离子体生物学方面的研究多是从等离子体产生角度着手,如采用不同气体、不同放电方式或不同的电源等物理角度推理和验证其生物机制,而且观点不一。对等离子体抑制细胞凋亡机制的系统研究几乎是空白。

综上所述,大气压冷等离子体射流有望成为临床治疗乳癌的一种新的技术手段,但这项技术距真正应用于临床还有大量工作有待完成。

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(本文编辑 马伟平)

STUDY ON APOPTOSIS OF BREAST CANCER CELLS INDUCED BY COLD ATMOSPHERIC-PRESSURE PLASMA JET

DING Weili,SUI Aihua,LIU Shihai,LIU Xiangping,WANG Jing,WANG Haibo (Center of Diagnosis and Treatment of Breast Disease,The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China)

ObjectiveTo study the effect of cold atmospheric-pressure plasma jet(CAPPJ)on apoptosis of MDA-MB-468 cells in breast cancer cell lines.MethodsA self-made CAPPJ device was applied in this study for MDA-MB-468 cells.The cells were exposed to CAPPJ for 10,30 and 90 seconds,respectively.That with no treatment served as blank-control group,that exposed to air stream only for 90 seconds served as experimental-control group.By using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay,the cell proliferation-inhibiting rate in each group was determined;by using DAPI dyeing,the morphologic changes of cell nucleus in each group were detected.The m RNA expressions of Bax and Bcl-2 were determined by real-time quantitative polymerase chain reaction(Real-time PCR).ResultsCAPPJ could obviously inhibit the cell proliferation with dose-dependent in nature (F＝22.4,42.3;P＜0.01),and air stream only did not impact MDA-MB-468 cells.After exposing to CAPPJ,pyknosis and nuclear fragmentation occurred,Bax expression up-regulated,and Bcl-2 down-regulated(F＝32.3,12.4;P＜0.05).ConclusionThe CAPPJ can inhibit the growth of MDA-MB-468 cells through inducing apoptosis.The mechanism may be associated with promotion of Bax and inhibition of Bcl-2 gene.

cold atmospheric-pressure plasma jet;breast neoplasms;apoptosis;genes,bcl-2;bcl-2-associated X protein

R737.9

A

1008-0341(2013)04-0305-04

10.11712/qlyx201304008

2013-03-14;

2013-06-06

山东省自然科学基金项目(Y2008C48)、山东省教育厅基金项目(J11LF65)

丁威利(1986-),男,硕士研究生。

王海波(1966-),男,博士,教授,硕士生导师。