透明质酸酶的提制、鉴定和临床应用研究

宋 怡 (吉林大学中日联谊医院风湿免疫科，吉林 长春 133000)

透明质酸酶又名玻璃尿酸酶，现已被《中国药典》收录，称为玻璃酸酶。上世纪五十年代末，原吉林医科大学第三临床学院基本外科利用它能分解细胞间黏合物质透明质酸(玻璃酸)的作用，提出了用此酶防治术后肠粘连的研究课题。当时国内此酶尚无自产品问世，进口量也很有限，不能满足本课题的大量需要。因而，提制能供临床应用的透明质酸酶成了开展此项研究课题的关键。在那个物资匮乏、学术交流停滞的年代，关于此酶的提制工艺和鉴定方法都无完整的资料可循，一切都须因陋就简、自力更生来设计实施。本研究分三个部分，即提制、鉴定和临床应用。

1 透明质酸酶的提制

本研究采用牛睾丸作为原料，研究过程中的所有步骤皆在4℃以下进行。将冷冻的牛睾丸去除包膜，将细精管研磨成匀浆，加等体积浓度为0.1 mol/L的醋酸溶液，浸出两次，12 h/次，并时加搅动。收集上清液，按每升加212 g之比例向上清液中缓缓加入硫酸铵，边加边快速搅动。收集沉淀。如向上清液中继续加入硫酸铵至其浓度达282 g/L，则仍有部分含酶沉淀析出。合并两次收集之沉淀，加蒸馏水至全溶为限。然后移至透析袋内，流水透析，以便将袋内液体中的无机盐去掉。收集袋中含酶的液体，冻干后，以本研究第二部分之方法鉴定。

按此工艺过程，共提取了27批制品，其中92%含酶量在每毫克300单位以上，皆可达到作为商品的质量要求。进一步精制，可将袋内液体移至容器中，按其体积的1/3缓缓加入95%的乙醇，并不断搅动。收集沉淀，加pH=6.5的McIlvaine缓冲液(含氯化钠0.28%)至其全溶为限。将溶液置于透析袋内，浸于蒸馏水中透析。收集袋中上清液，冻干后鉴定，则可得含酶量在每毫克550～600单位的精制品。精制后虽酶的含量增加，但收获量较低，不宜于生产;只作为中央药检所委托生产的鉴定用的标准品。

所有各批制品，皆做了酪氨酸含量检查，结果以一个单位中的微克数(μg/单位)来表示，皆在 0.3 ～0.7 μg/单位之间，只有一批精制品为0.15μg/单位，仍高于进口品Rodanse的含量水平(0.105 μg/单位)。本制品的结果虽差强人意，但对化学活性和生物活性皆未见影响。

各批产品经中央药检所抽检复验，确认其质量合乎生产要求。与此同时各批产品皆在药理科指导下做了安全试验，未发现有致痛、致炎和致敏等不良作用，急性毒理试验阴性，细菌和霉菌培养均无生长，pH在5.8～7.0之间。制品经卫生部审核，于1960年6月得到批准正式生产，供科研及临床需要，以补充进口品之不足。

2 透明质酸酶的鉴定

完整的透明质酸酶鉴定应包括化学活性鉴定(即观察它分解底物透明质酸的能力)和生物活性鉴定(即观察它在生物组织间的扩散能力)。

2.1 化学活性鉴定

2.1.1 鉴定法设计原理:是基于此酶的底物透明质酸与显浊剂酸化白蛋白相遇会产生混浊;如事先将透明质酸酶与定量的透明质酸混合温育，则浊度随酶量的增加而减低直至透明，以此来反映酶活性的大小。

2.1.2 试剂的配制:实施这一设计，必须有做对比用的标准透明质酸酶、透明质酸和显浊用的酸化白蛋白，但当时在市上皆无供应，亦未见到公认的规范鉴定法。面对这些困难，本研究采取了下述措施:①对比用的标准透明质酸酶:权且以英产Rondase充当，实际就是用Rondase的单位做标准来鉴定本制品，也就是将Rondase的单位转用于本制品。为此，首先需测出一个单位的Rondase最大能分解多少量的透明质酸，做法是，向一系列的试管中加入不同量的透明质酸，再向各管分别加入一个单位Rondase，经温浴显浊后，浊度完全消失的管中含有的最大透明质酸量就是一个单位Rondase所能完全分解的最大透明质酸量;如被检制品也能将该量透明质酸完全分解，则其中最低含酶量必然相当于Rondase的一个单位。本研究中用于透明质酸酶的单位，都是Rondase的单位。本制品的化学活性，就是以每毫克制品中含酶多少单位来判定的。②透明质酸:是本研究由人脐带间质中提制的。方法是将间质用最少量的蒸馏水溶解，离心后取上清，然后用丙酮脱水而制成。③显浊用的酸化白蛋白:本研究用酸化正常人血清代替，是用人血清加10倍的醋酸盐缓冲液稀释，然后用4 mol/L的盐酸调至pH=3.10而制成。

2.1.3 鉴定的具体程序:向一系列试管中预加0.5 ml相当于本品一个单位的透明质酸溶液;随即向各管中加入不同体积、同一浓度(一般用1 mg/ml)的被检品溶液，并用pH=4.2的醋酸盐缓冲液补足至1ml;置于37.5℃水浴槽中温育30 min后，迅速加入0℃、pH=4.2的醋酸盐缓冲液3 ml以中止反应;再向各管中加入酸化血清1 ml显浊，用600 nm波长比浊。使浊度完全消失的最低浓度的被检品中的含酶量为该制品的一个单位。例如，加入的被检品量为2 μl，则被检品中含酶量为每毫克500单位。

2.2 生物活性鉴定:生物活性指透明质酸酶在生物体中分解透明质酸的作用。一般以人为的色素斑点扩散面积的大小来表示。本研究用人血红蛋白液作为指示剂。

有两种鉴定方法:①简便鉴定法:向两侧兔耳内面皮下各注入指示剂0.1 ml，形成色点，然后向一侧色点中注入含0.1单位的透明质酸酶0.1 ml，向另侧色点中注入0.1 ml生理盐水作为对照，对比两侧色点扩散面积。如含酶的色点扩散面积大于对照色点，则提示被检酶具有生物活性。本研究各批制品用此法鉴定皆显示有生物活性。②最大扩散力鉴定:以注入酶的色点不再扩散时的酶的稀释度来代表。做法是，将新剥兔皮内面向上固定于38℃的木板上，向预注有指示剂的色点中注入0.1 ml不同稀释度的透明质酸酶。色点的扩散面积随酶的浓度减低而减小，当面积与不含酶的色点相同时的稀释度，即为此酶的最大扩散力。此法适用于不同产品的酶活性对比，但不适于常规应用。本制品有8批按此法做了生物活性鉴定，最大扩散力皆大于1 024。

3 本提制品的临床应用研究

3.1 防治术后肠粘连:共30例，其中13例术前有粘连，用此酶后，10例未发生梗阻症状，有2例发生不全梗阻，经保守疗法治愈，1例因粘连而再次手术。另17例为腹部大手术后为了预防粘连而使用的，术后皆未发生梗阻症状。就以上观察及武汉医学院动物试验之报告，此酶对防治腹腔粘连有一定效果。

3.2 促进皮下输液的扩散:共用于25例患者，并用生理盐水作为对照。结果显示加酶后液体扩散迅速，皮下输液速度最快可达半小时700 ml，输液中患者无痛感。此酶对促进皮下液体扩散有肯定之效果。

3.3 加速局部麻醉生效时间，扩大局部麻醉面积:共用于14例患者，效果显著;麻醉维持之时间短，但可加肾上腺素以纠正之。

3.4 促进血肿消散:已用于4例患者，有3例新鲜血肿注射此酶后血肿迅速消散，另1例血肿已超过24 h，故消散较慢。结合上海医学院之报告，此酶对促进新鲜血肿之消散有肯定效果。

3.5 促进漏于皮下之高渗及有刺激性药物之消散:在门诊用于2例患者(分别为氯化钙和去甲肾上腺素)，注入此酶后，局部刺激症状迅速消失，皮肤免于坏死。

3.6 曾试用于检测滑膜液中的透明质酸，检测方法同上述透明质酸酶鉴定的具体程序，只是用检品代替透明质酸。按加入的不同量的透明质酸酶引起的浊度改变画成曲线，以浊度为零时最小酶量做单位，此单位与滑膜液中的透明质酸量成正比。当时因无标准透明质酸，未能定出滑膜液中透明质酸的正常值，因而未形成正规的检验项目。

研究中所参阅的主要文献

［1］Freeman Me，Anderson P，et al.Preparation of Purified Hyaluronidase from bovine testis［J］.J Biol Chem，1949，180(2):655.

［2］Colowick，et al.Method in Enzymology［M］.1:171-172 N.Y Academic Press Inc，1956.

［3］Tolksdorf S，Mccready Mh，et al.The Turbidimetric Assay of Hyaluronidase［J］.J Lab Clin Med，1949，34(1):74.

［4］Hadidian Z，Pirie NM，et al.The Preparation and Some Properties of Hyaluronic Acid from Umbilical Cord［J］.Biochem J，1948，42(2):260.