鳕鱼骨胶原蛋白肽的抗氧化活性

赵 玲， 李 亚， 刘 淇*， 曹 荣

（1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所，山东 青岛 266071；2.山东永康食品有限公司，山东 烟台264006；3.烟台嘉惠海洋生物科技有限公司，山东 烟台 264006）

随着水产品加工技术和食品冷链物流技术的进步，以冷冻鱼片、预调理水产品为代表的水产品加工业得到了快速发展。与此同时，在水产品加工过程中产生了大量的鱼皮、鱼骨等下脚料尚未得到充分利用。因此，综合利用水产品加工下脚料，不仅是水产品加工的一个重要研究方向，也是提高水产品加工业经济效益和社会效益的必然要求。

研究表明，鱼骨可用于制作多种食品，也可用于提取胶原蛋白、软骨素及制备CMC活性钙等[1]。目前，国内外关于从鱼类加工下脚料中制备胶原蛋白或肽制品的研究报道很多[1-5]，其中以鱼皮为原料的研究居多[6]，而关于鱼骨胶原蛋白的研究相对较少。抗氧化肽以其相对分子质量小、易吸收、活性强等特点受到重视，在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面有广阔前景[7-8]。作者以鳕鱼骨为研究对象，旨在通过对其胶原蛋白肽的抗氧化活性研究，为鳕鱼骨在保健食品和医药等领域的开发与利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳕鱼排:太平洋真鳕（Gadus macrocephalus）加工下脚料，烟台嘉惠海洋生物科技有限公司提供。

中性蛋白酶（1.3×105U/g）:吉宝（青岛）生物科技有限公司产品；复合蛋白酶（1.0×105U/g）:诺维信生物技术有限公司产品；酸性蛋白酶（5.0×104U/g），北京东华强盛生物技术有限公司产品；胃蛋白酶（≥1.2×103U/g），国药集团化学试剂有限公司产品；其它试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

数显恒温水浴锅HH-2，国华电器有限公司产品；N-1001型旋转蒸发仪:上海爱朗仪器有限公司产品；CoolSafe 110 Freese Dryer:LABGENE公司产品；UV-2082型紫外可见分光光度计:尤尼柯 （上海）仪器有限公司产品；PB-10型 pH计:Sartorius公司产品；L-550型台式低速离心机:湘仪离心机仪器有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 鳕鱼骨胶原蛋白的提取 提取工艺流程:鳕鱼排→漂烫→去肉→清洗→热水浴提取→过300目筛→微滤→真空浓缩→醇沉→冷冻干燥→鳕鱼骨胶原蛋白粉

1.3.2 鳕鱼骨胶原蛋白肽的制备 取粗制的鳕鱼骨胶原蛋白粉配制成质量浓度为10 mg/mL的溶液，分别用中性蛋白酶、复合蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶在各自最适酶解条件下进行酶解 （见表1），酶解完成后90℃灭酶15 min，4 000 r/min离心20 min后取上清液，冻干后得鳕鱼骨胶原肽P中性、P复合、P胃和 P酸性，于-20℃储藏备用。

表1 不同蛋白酶酶解条件Table 1 Hydrolysis conditions of different enzymes

1.3.3 抗氧化活性测定

1）鳕鱼骨胶原蛋白肽对DPPH·自由基清除率的测定 DPPH·是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，在517 nm波长处有最大吸收，与抗氧化剂反应时，其孤对电子与抗氧化剂中的电子配对使其乙醇溶液由紫色褪色成黄色，褪色程度反映出抗氧化剂的活性强弱[9]。

测定方法参照文献[10]进行。向不同试管加入等体积不同浓度的溶剂、鳕鱼骨胶原蛋白肽，混匀后25℃反应30 min，在517 nm下测定其OD值，平行做3次取平均值。

2）对·OH自由基清除率的测定 ·OH是造成组织细胞损伤的重要活性氧之一。人体在正常的生命活动中通过新陈代谢即可以产生·OH，它可以引起膜过氧化、蛋白质交联变性、核酸损伤等，是公认的毒性最大的自由基[11]。因此，·OH的检测在自由基损伤研究中有着重要的意义。

测定方法参照文献[12]进行，加入鳕鱼骨胶原蛋白肽后将溶液混合均匀，37℃水浴保温30 min，在510 nm下测定其OD值，平行做3次取平均值。

3）对O2-·自由基清除率的测定 邻苯三酚在弱碱条件下发生自氧化反应产生O2-·，O2-·清除剂能使邻苯三酚自氧化产物在325 nm处吸收峰受到抑制。采用光化学方法监测，可间接测得O2-·的生成及O2-·的清除率[13]。测定方法参照文献[14-15]进行，加鳕鱼骨胶原蛋白肽后将溶液混合均匀，于325 nm波长处测定其OD值，平行做3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 鳕鱼骨胶原蛋白肽对DPPH·的清除效果

4种蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对DPPH·的清除能力结果见图1。由图1可知，从总体上看4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽对DPPH·的清除能力随着样品质量浓度的增加而增强；多肽质量浓度在2～4 mg/mL时，4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽对DPPH·的清除能力顺序为 P酸性＞P胃＞P中性=P复合； 在 6～12 mg/mL时，清除能力顺序为 P酸性＞P中性＞P复合＞P胃。 4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽对DPPH·的清除能力均明显高于王东等[16]提取的鲑鳟鱼骨胶原蛋白肽（3 mg/mL，13.33%），推测这可能与多肽的提取制备工艺和鱼骨的品种有关。

图 1 4种蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对DPPH·的清除能力Fig.1 Scavenging capacities of four kinds of collagen peptides from cod bone to DPPH·free radical

2.2 鳕鱼骨胶原蛋白肽对O2-·的清除效果

4种蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对O2-·的清除能力见图2。由图可知，在受试浓度范围内，4种蛋白酶酶解胶原肽的清除能力均随样品质量浓度增大而增强；中性蛋白酶和复合蛋白酶酶解胶原蛋白肽对2-·的清除能力较大，当多肽质量浓度为6 mg/mL时，二者对O2-·的清除能力相同；酸性蛋白酶酶解胶原蛋白肽居中；胃蛋白酶酶解胶原蛋白肽的清除能力最弱，且明显小于其它3种蛋白酶的酶解胶原蛋白肽。

图 2 4种蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对O2-·的清除能力Fig.2 Scavenging capacities of four kinds of collagen peptides from cod bone to O2-·free radical

2.3 鳕鱼骨胶原蛋白肽对·OH的清除效果

4种蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对·OH的清除能力见图3。由图3可知，在受试质量浓度范围内，4种蛋白酶酶解胶原肽对·OH清除能力均随质量浓度的增大而增强，且有较好的量-效关系；清除能力顺序为 P中性＞P复合＞P酸性＞P胃。 多肽质量浓度在0.75 mg/mL至1.25 mg/mL时，中性蛋白酶和复合蛋白酶对·OH清除能力随质量浓度的增加而急剧增强。经比较知，4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽对·OH的清除能力与王东等[16]提取的鲑鳟鱼骨胶原蛋白肽（3 mg/mL，11.24%）相比有显著提高，其中，当质量浓度为0.1 mg/mL时，中性蛋白酶酶解胶原蛋白肽对·OH的清除率达到14.1%。

图3 4种蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对·OH的清除能力Fig.3 Scavenging capacities of four kinds of collagen peptides from cod bone to·OH free radical

经比较可知，尽管胃蛋白酶酶解胶原蛋白肽对·OH清除能力最弱，当质量浓度为1.5 mg/mL时，胃蛋白酶酶解胶原蛋白肽对·OH的清除率仍达到27.97%，均大于4种蛋白酶酶解胶原肽在质量浓度为2 mg/mL时对DPPH·和O2-·清除率，因而4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽对·OH的清除能力明显优于其它2种自由基。

2.4 蛋白酶酶解胶原蛋白肽对DPPH·和O2-·自由基的清除效果比较

比较图4～7可知，同一种蛋白酶酶解胶原蛋白肽对DPPH·和O2-·自由基的清除能力各不相同；多肽浓度在4～10 mg/mL时，4种蛋白酶酶解胶原蛋白肽对DPPH·的清除能力均大于对O2-·自由基的清除能力。

图4 中性蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对2种自由基的清除能力Fig.4 Scavenging capacity of collagen peptide prepared by neutral protease to two kinds of free radicals

图5 复合蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对2种自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of collagen peptide prepared by protamex to two kinds of free radicals

图6 胃蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对2种自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of collagen peptide prepared by acidic protease to two kinds of free radicals

图7 酸性蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白肽对2种自由基的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of collagen peptide prepared by pepsin to two kinds of free radicals

3 结语

我国鳕鱼年加工量（4～5）×105t[17]，在其生产过程中会产生鱼骨等大量下脚料，鳕鱼骨中富含胶原蛋白，蛋白质质量分数约为35.78%[1]。作者通过热水浸提法制备鳕鱼骨胶原蛋白，采用4种酶分别酶解鳕鱼骨胶原蛋白制备胶原蛋白肽，并测定了其对·OH、DPPH·和O2-·3种自由基的清除效果。结果表明:中性蛋白酶、复合蛋白酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶酶解鳕鱼骨胶原蛋白制得的胶原蛋白肽其抗氧化活性较强，其对3种自由基的清除能力均随样品质量浓度的增大而增强，但不同蛋白酶酶解胶原蛋白肽对3种自由基的清除能力各不相同。因此，鳕鱼骨胶原蛋白肽在功能性食品、化妆品及生物制药等方面具有很好的应用潜力，值得进一步研究、开发。

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