新型复合酶在肉鸡饲料中的应用

杨道秀， 李夏兰， 陈培钦， 王林林

（华侨大学 化工学院，福建 厦门 361021）

在家禽饲养上，随着玉米供给量的缺口越来越大，人们逐渐利用小麦、大麦和燕麦等饲料原料代替玉米来饲养家禽，但是当这类原料在家禽日粮中含量过多时，往往会造成饲料利用率差、家禽生长不良以及环境污染等问题，这主要与高木质纤维饲料原料中存在非淀粉多糖抗营养因子有关，这些抗营养因子会增加消化道食糜粘性，影响消化道生理形态，阻碍营养物质消化吸收，降低饲料转化率，影响肠道菌群，对家禽的健康成长造成不利的影响。消除抗营养因子的方法很多，主要包括物理方法、化学方法及生物方法。非淀粉多糖酶作为一种“绿色”添加剂，被认为是目前消除非淀粉多糖抗营养因子最有效的方法之一。饲料中的非淀粉多糖降解酶，主要包括木聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶等[1-4]。从整个世界范围来看，饲料酶的添加率不足60%，而在中国尚不足20%，饲料酶的应用还具有很大的上升空间。

研究结果表明，在禾本植物纤维中，反式阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，ferulic acid，简称FA）是含量最多的酚酸，在谷物的细胞壁中，反式FA主要是以酯键与半纤维素连接。半纤维素中的FA、双FA含量及连接方式决定了细胞的延长性、可塑性及降解性，因此断裂FA与半纤维素连接的酯键是提高半纤维素降解程度的重要因素[5]。阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73，feruloyl esterase，简称 FAE），是重要的细胞壁降解酶，其主要生物功能是水解多糖与FA连接的酯键，释放FA[6-7]。目前国内的发酵饲料中还未有添加FAE的报道。课题组的前期研究结果及已有报道都表明，木聚糖酶及FAE能够共同降解植物细胞壁，同时释放 FA和低聚木糖（xylooligosaccharide，简称 XOS）[8-10]。 XOS 其无毒安全的特性，已成为最具潜力的动物保健品和抗生素替代品[11]。FA具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗突变、抗癌、抗动脉粥样硬化、抗血栓、降低胆固醇和降血脂等生理功能，在日本，反式FA已应用于食品添加剂中[12]。随着畜牧业的迅速发展，研发高质量的饲料已经成为国内外研究的热点。另外，随着经济社会的发展，抗生素的危害已经越来越为人们所熟知，抗生素的少用或者不用是必然的发展方向。

作者主要报道了实验室自行发酵的FAE及商品饲料酶-溢多酶（主要含木聚糖酶（25 000 U/g）、纤维素酶（800 U/g）、甘露聚糖酶（2 000 U/g）、β-葡聚糖酶（30 000 U/g）、α-淀粉酶（300 000 U/g））酶解麦糟的工艺，及将酶解后的麦糟添加于饲料中饲喂肉鸡的实验结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 反式阿魏酸标准品:Sigma公司产品；阿魏酸甲酯:华侨大学曾庆友老师自行合成；低聚木糖标准品、木二糖标准品:日本和光纯药工业株式会社产品；葡萄糖标准品:上海国药化学试剂有限公司产品；溢多酶AF831:广州溢多利公司产品；玉米及豆粕:厦门市振裕饲料有限公司产品；预混料:厦门百惠行科技有限公司产品；麦糟:厦门青岛啤酒厂产品。

1.1.2 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪:美国安捷伦公司产品；HPX-42A柱:美国Bio-Rad公司产品；ODS-C18色谱柱:美国Thermo公司产品；SP-2102UV紫外可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司产品；超滤膜包Vivaflow 200:北京赛多利斯仪器有限公司产品。

1.1.3 菌种 黑曲霉:作者所在实验室筛选保藏。

1.1.4 鸡苗 青脚麻鸡:厦门五显镇三秀种禽厂提供。

1.2 培养基及其培养条件

1.2.1 种子培养基 PDA培养基，36℃培养2 d。

1.2.2 发酵培养基 将麦糟烘干过65目筛，按m（麦糟）︰m（麦麸）=4︰1的比例，每个搪瓷盘中加入麦糟和麦麸的混合物50 g及75 mL营养盐溶液，混匀，121℃灭菌30 min。每个搪瓷盘中接种12.5 ml菌液，33℃培养6 d。

营养盐溶液:蛋白胨 2 g，酵母粉 4 g，NaH2PO4·2H2O 1.52 g，KH2PO41 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，Na2HPO4·12H2O 31.4 g，Na2HPO4·2H2O 15.6 g，用蒸馏水定容至1 L。

1.2.3 FAE粗酶液制备

1）发酵培养基抽提 将发酵液加入1 000 mL蒸馏水，置于33℃，180 r/min的摇床中振荡2.5 h，取出静置，用8层纱布过滤。

2）发酵液浓缩 在超滤膜相对分子质量为30 000，进口压力为0.1 MPa，进料速度为200 mL/min，20℃操作条件下，超滤浓缩，浓缩后的FAE酶活达到20 U/mL以上。

1.3 各种物质测定方法

1.3.1 FA测定 按文献方法分析[13]。

1.3.2 XOS测定 按文献方法分析[13]。

1.3.3 还原糖测定 采用DNS法[14]。

1.4 复合酶酶解麦糟工艺研究

1.4.1 FAE添加量对麦糟酶解效果的影响 称取5 g含水量70%的麦糟置于50 mL三角瓶中，固定溢多酶的添加量为质量分数0.012%，分别以0、11、22、33、44、55 U 添加浓缩后的粗酶液，50 ℃， 酶解24 h。酶解后，往每个锥形瓶中加入20 mL的蒸馏水，40℃，浸提 2.5 h后，4 ℃，10 000 r/min，离心 20 min。取上清液测定FA、XOS、还原糖含量。

1.4.2 不同温度对麦糟酶解效果的影响 添加FAE 8.8 U/g 麦糟， 控制酶解温度为 20、30、40、50、60℃，其他操作同1.4.1。

1.4.3 不同酶解时间对麦糟酶解效果的影响 酶解温度为 40 ℃， 控制酶解时间为 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 d，其他操作同 1.4.2。

1.4.4 不同含水量对麦糟酶解效果的影响 酶解时间为 2.5 d， 调节麦糟含水量为 30、40、50、60、70%，其他操作同1.4.3。

1.4.5 不同的酶解方式对麦糟酶解效果的影响麦糟含水量为 50%，按（1）～（5）组添加各酶液，其他操作同1.4.4。

（1）不加任何酶液，放置 60 h；（2）往麦糟中添加溢多酶0.006%，酶解24 h后，添加溢多酶0.006%（g/g 麦糟），再酶解 36 h；（3）往麦糟中添加FAE 4.4 U/g麦糟，酶解24 h后，添加FAE 4.4 U/g麦糟，再酶解 36 h；（4）往麦糟中添加FAE 8.8 U/g麦糟及溢多酶 0.012%（g/g麦糟）， 酶解 60 h；（5）往麦糟中添加0.006%溢多酶，酶解12 h后，添加FAE 4.4 U/g麦糟，酶解12 h后；加入溢多酶0.006%，酶解12 h后，最后加入FAE 4.4 U/g麦糟，酶解24 h。

1.5 复合酶对肉鸡生产性能的影响

1.5.1 麦糟的处理及饲料配方

1）麦糟的处理 各组麦糟分别按如下处理:Ⅰ组，每克含水量50%的麦糟加入0.3 mL蒸馏水；Ⅱ组，每克含水量50%的麦糟加入0.3 mL蒸馏水及溢多酶0.012%；Ⅲ组，每克含水量50%的麦糟加入6.6 U FAE粗酶液；Ⅳ组，每克含水量50%的麦糟加入6.6 U FAE粗酶液及0.012%溢多酶；将上述麦糟在40℃下酶解60 h后，按肉鸡日粮配方添加入饲料中。

2）饲料配方及营养水平 肉鸡日粮标准参照（NY/T33-2004鸡饲养标准）中肉鸡营养需要，配制成粉状饲料，粗蛋白含量为19%，代谢能为12.34 MJ/kg。

3）实验分组 选用15日龄青脚麻鸡，称重，选出实验鸡，将肉鸡分为4组，每组5个重复，每个重复8 只鸡（公母混合雏），实验组 1、2、3、4 添加的麦糟分别按上述Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的方法处理，其他成分相同。

1.5.2 肉鸡饲养及管理 试验场地为厦门市“仙灵旗”生态农牧科技有限公司新搭建养鸡场。采用地面平养方式饲养，全天光照，每天饲喂3次，自由采食、饮水，定时对鸡舍进行消毒清扫（每周两次），预饲期3 d，实验时间为24 d，按正常肉鸡免疫程序进行免疫。在第17 d，41 d的早晨9:00空腹称重，记录投料量与剩料量，统计肉鸡的死亡率，计算每只鸡日增重，平均日采食量，料肉比。

1.5.3 数据统计分析 数据采用SPSS 19.0软件的ANOVA进行方差分析，Duncan法进行多重比较，各组数据以平均数±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 复合酶酶解麦糟工艺

2.1.1 添加不同量FAE对酶解效果的影响 添加不同FAE酶量对麦糟进行酶解，结果如图1。

图1 添加酶量对酶解效果的影响Fig.1 Influenceoftheamountofenzymeon the enzymatic hydrolysis effect

由图1可知，随着FAE添加量的增大，FA、还原糖和XOS的含量都逐渐增大。添加的FAE酶活为6.60 U/g麦糟时，酶解得到的XOS含量达到最大，为1.76 g/L；添加酶量为8.80 U/g麦糟时，FA含量达到最大，为0.66 mg/L。但是进一步加大酶的添加量，FA及XOS的含量却减少，一方面可能是酶液中的FA对酶产生抑制作用，从而影响了酶对麦糟的酶解效果；同时在固定溢多酶的添加量时，只有使得FAE添加的量合适，才能使两者的协同作用达到最大。综合考虑，选择FAE的添加量为6.60～8.80 U/g麦糟，酶解效果较好。

2.1.2 不同温度对酶解效果的影响 在不同温度下进行酶解，结果如图2。

图2 温度对酶解效果的影响Fig.2 Influence oftemperatureon theenzymatic hydrolysis effect

由图2可知，随着温度的升高，FA、还原糖及XOS的质量浓度均有所增加，当温度达到40℃时，FA及XOS的含量都达到最大，分别为0.52 mg/L和2.41 g/L，但是随着温度的继续升高，两者的质量浓度都下降，主要的原因是FAE和木聚糖酶都是不耐热的酶，当温度超过40℃时，酶活稳定性迅速降低[15-16]。温度达到50℃时，还原糖的质量浓度达到最大，为4.33 g/L，温度继续升高还原糖含量也下降。由此可知，复合酶最佳的酶解温度为40℃，此时复合酶的协同效应最佳。

2.1.3 不同酶解时间对酶解效果的影响 对麦糟酶解不同时间，结果如图3。

图3 酶解时间对酶解效果的影响Fig.3 Influence of the time on the enzymatic hydrolysis effect

由图3可知，随着酶解时间的延长，各个产物质量浓度均在不断的增加，2 d时，还原糖达到最大值，为3.72 g/L，而2 d之后随着时间的延长含量逐渐下降。FA及XOS则在2.5 d时达到最大值，分别为0.63 mg/L和1.20 g/L。反应酶解时间超过60 h，各产物的含量均在降低。这是因为随着酶解时间的延长，FA和XOS易被氧化而破坏。由于在2.5 d时，FA及XOS达到最高值，且还原糖含量也处于一个较高值，因此选定2.5 d为最佳的酶解时间。

2.1.4 不同水分质量分数对酶解效果的影响 在不同水分质量分数下对麦糟进行酶解，结果如图4。

图4 水分质量分数对酶解效果的影响Fig.4 Influence of the water content on the enzymatic hydrolysis effect

由图4可知，当麦糟水分质量分数为50%时，酶解得到的FA、还原糖和XOS的含量都达到最大，分别为0.64 mg/L，4.20 g/L和1.95 g/L。当麦糟水分质量分数高于或者小于50%时，FA、XOS和还原糖质量浓度都下降。因此选定50%为最佳的水分质量分数，进行酶解。

2.1.5 不同酶解方式对酶解效果的影响 采用1.4.5的方法进行实验，结果如图5。

图5 不同酶解方式对酶解效果的影响Fig.5 Content of each enzymatic hydrolysis product

由图5可知，同时加入溢多酶和FAE的实验组XOS及还原糖质量浓度最高，达到了5.1 g/L和3.87 g/L，FA质量浓度也较高，达到0.98 mg/L，所得的FA、XOS和还原糖含量较未添加任何酶的对照组分别提高了1.88倍，50倍，19.37倍；只加入溢多酶的实验组FA含量最高，达到了2.25 mg/L，但XOS和还原糖质量浓度都很低；只加入FAE的实验组FA、XOS和还原糖质量浓度分别为0.84 mg/L，3.32 g/L，2.03 g/L，但是比两种酶都加的效果差；分批加入溢多酶及FAE的各物质含量比起同时添加的质量浓度都低，FA、XOS和还原糖含量为0.91 mg/L，3.63 g/L，2.06 g/L。由此可知两种酶协同降解麦糟比单独添加，降解的效果更为显著，多酶协同降解麦糟具有更大的优越性，两种酶同时添加的效果又比分批添加的效果要好。

2.2 复合酶对肉鸡死亡率的影响 将按5.2.4.1处理后的麦糟，以7%的比例添加入肉鸡基础日粮中，肉鸡饲养成活率结果如表1。饲喂全程中，饲料中未添加任何的抗生素及其他的药，由表1可知各组鸡的病死亡率均为0，差异不显著（P<0.05），病死亡率中并未体现出（溢多酶+FAE）组抗病的优势。这可能与新建场地卫生条件好，通风，未遇到瘟病有关。

表1 复合酶对肉鸡成活率的影响Tab.1 Effect of compound enzyme on survival rate of broiler

2.3 复合酶对肉鸡生产性能的影响

按1.5.2进行肉鸡饲养，饲养结果如表2。从表2可知，与对照组相比，溢多酶组和（FAE+溢多酶）组均能提高肉鸡日增重，分别提高了0.78%，4.37%，但是差异不显著。而溢多酶组、FAE组和（FAE+溢多酶）组均有降低日采食量的趋势，分别降低了3.28%，4.83%，3.51%，但是差异不显著（P﹥0.05）。（FAE+溢多酶）组对降低料肉比具有极显著的作用（P<0.01），降低了7.63%；而添加FAE组及溢多酶组均能降低料肉比，分别降低了3.25%、4.01%，但是差异不显著（P﹥0.05）。

表2 复合酶对肉鸡生产性能的影响Tab.2 Influence of compound enzyme on the production performance of broiler

Yu等[17]报道了将FAE、木聚糖酶、纤维素酶及β-葡萄糖酶共同作用，燕麦的消化性比不加FAE提高了79%。Bartolome等[5]把来自黑曲霉的FAE或荧光假单胞杆菌的FAE与木聚糖酶共同作用于大麦和小麦的细胞壁，其游离的FA释放量提高了2-6倍。但单独使用FAE降解植物细胞壁，降解率也是较低的。Topakas等[18]报道，FAE与木聚糖酶同时作用从植物细胞壁中释放的FA量是仅木聚糖酶单独作用时的6.3倍。作者主要是在饲料中同时添加溢多酶和FAE，二者对木质纤维的降解具有协同作用，共同促进植物细胞壁的降解提高饲料的饲用效率，促进营养物质的吸收利用，同时产生FA及XOS也具有生理活性。

3 结语

1）麦糟酶解工艺最佳酶解条件为:时间2.5 d，操作温度40℃，水分质量分数为50%，添加酶量为6.6～8.8 U/g麦糟。同时添加FAE和溢多酶，对麦糟的酶解效果较好，所得的FA、XOS和还原糖质量浓度较未添加酶的实验组分别提高了1.88倍，50倍，19.37倍。

2）FAE及溢多酶均能够促进肉鸡的生长，但效果不显著，而同时添加FAE及溢多酶组能够显著促进肉鸡的生长，日增重提高4.37%，料肉比降低7.63%。

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