内耳基因治疗的研究进展*

吴学文 综 述 孙 虹 审 校

内耳基因治疗的研究进展*

吴学文1，2综 述 孙 虹1，2审 校

由于先天性异常、后天性损伤如病毒性疾病和耳毒性药物以及老年退行性变等原因，内耳疾病患者不断增多。内耳疾病主要表现为听力下降和眩晕，重者导致语言交流障碍和行动困难，是一类严重影响人类正常生活的常见难治性、致残性疾病。内耳疾病的病理以耳蜗和/或前庭感觉上皮的细胞（如毛细胞和支持细胞）及神经元不同程度受损为主，在临床上表现为各种感音神经性聋（如遗传性聋、突发性聋、噪声性聋、药物性聋、老年性聋和自身免疫性聋等）及各类前庭周围性眩晕（如梅尼埃病）等。

迄今为止，大部分内耳疾病仍无较为有效的治疗方法。近年来，相关动物实验研究表明，向内耳转染特定的目的基因（如NT3［1］、Math1［2］、SOD1［3］等），能有效避免毛细胞和/或神经元的死亡，并能提高实验动物的听觉功能，提示内耳基因治疗是一种非常有希望的治疗手段。在内耳基因治疗研究领域中，各种新型基因载体、治疗目的基因、给药方法等方面的探索研究均取得了较大的进展。本文从内耳疾病的流行病学资料、内耳基因治疗发展历史、研究现状等进行综述。

1 致残性内耳疾病及其流行病学资料

据世界卫生组织（WHO）估计，2005年全球听力残疾人数2.78亿，约占全球人口总数的4.6%；80%的听力障碍者生活在中、低收入国家；WHO推测到2050年，全球听力障碍的人数将上升至9亿［4］。2006年我国各类残疾人总数为8 296万，其中听力残疾2 004万，居残疾人总数的第二位；7岁以下聋儿达80多万，且每年新增聋儿3万余名；50～80岁人群中，中度到重度感觉神经性聋的患病率达50%［5］。中国贵州省的调查显示，听力减退患病率为17.1%，全国标准化患病率为17.6%；听力残疾患病率为6.1%，全国标准化患病率为6.5%；13.8%的调查对象需要耳科和听力学干预［6］。因此，预防聋与听力减退已成为全球关注的任务。

同样需要关注的内耳疾病是前庭性眩晕，以梅尼埃病和良性阵发性位置性眩晕为代表，具有复发性和难治性的特点，二者均为眩晕门诊的常见病［7］。梅尼埃病的病因尚未明确，但反复发作的梅尼埃病也可导致耳蜗感觉细胞的退行性变，最终发展为听力减退甚至听力残疾。

2 内耳基因治疗的发展历史

基因治疗是随着DNA重组技术的成熟而发展起来的，它被认为是医学和药学领域的一次革命，是当今生物医学发展最重要的里程碑之一，同时也必将对传统制药业产生深远影响和冲击［8］。

20世纪60年代末70年代初，国外研究者们首次用病毒包裹DNA片段后成功地将其转染入小鼠和人类的胚胎细胞中，此后基因治疗被认为是未来治疗一些难治性的遗传性或基因突变疾病最有效的方法之一。基因治疗在耳科研究中起步较晚，1996年Lalwani及Raphael分别用腺相关病毒和复制缺陷腺病毒成功地将目的基因转染入豚鼠的内耳细胞中。从21世纪初开始，国内学者才开始尝试活体动物的内耳基因治疗。2001年，郭维等［9］用腺病毒介导LacZ基因经圆窗注入豚鼠内耳，2天后LacZ基因成功表达于Corti器的内外毛细胞、螺旋神经节细胞、基底膜下的间皮细胞上。此后，阳离子脂质体、无机纳米材料等非病毒载体也被应用于内耳基因治疗。国内外研究者们相继利用各种病毒或非病毒载体将相关目的基因经不同的转染方式成功地转染进入体外培养和/或活体动物的内耳细胞内。

3 内耳基因治疗的研究现状

在基因治疗方面，内耳拥有其它器官无法比拟的优势。从解剖上，它相对封闭、处于骨性结构包绕中，与周围组织处于相对隔离状态；流动的外淋巴有利于载体在整个耳蜗的鼓阶与前庭阶内扩散，而流动的内淋巴有利于载体在整个膜蜗管内扩散［10］。目前内耳基因治疗的研究热点主要集中在以下三个方面：①内耳基因治疗因子；②内耳基因治疗载体；③内耳基因治疗给药途径。

3.1 内耳基因治疗因子 目前用于内耳基因治疗研究的基因主要有六类：①神经营养因子类［11～13］：神经营养－3（neurotrophin－3，NT3）、脑源性神经营养因子（Brain－derived neurotrophic factor，BDNF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、胶质源性神经生长因子（glial cell line－derived nerve growth factor，GDNF）及其他类型生长因子等，神经营养因子基因转导进入内耳后，可有效抑制螺旋神经节细胞在外毛细胞死亡后的退行性变并可能促进螺旋神经节细胞轴突的再生；②抗凋亡基因：如XIAP［14］及Bcl－2家族［15］等，抗凋亡基因转导入内耳后表达的相关产物能有效抑制耳毒性药物如顺铂及庆大霉素的促凋亡作用而发挥保护作用；③b HLH转录因子家族：如Math1［2］及Hath1［16］等，成年动物内耳中Math1或Hath1的过度表达可使Corti器出现新的类毛细胞，提示Math1或Hath1基因在内耳成熟的非感觉上皮细胞向毛细胞分化中是必不可少的促进因子；④抗氧化因子基因［3］：如超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）SOD1、SOD2，超氧自由基、羟自由基和过氧化氢等活性氧（reactive oxygen species，ROS）常引起耳蜗细胞不可逆的损害，导致噪声性、药物中毒性、缺血再灌注性及老年性等感音神经性聋的发生，而SOD1及SOD2能有效拮抗耳蜗细胞中的氧化应激作用而发挥保护听力及毛细胞的作用；⑤耳蜗连接蛋白基因［17，18］：如CX26（GJB2）、CX30（GJB6）等；⑥耳蜗蛋白基因［19］（otospiralin）及白细胞介素1基因等。这些基因分别通过不同的机理对内耳及耳蜗起保护作用或促进毛细胞再生作用。

3.2 内耳基因治疗载体 当代科技水平尚不能使人类内耳毛细胞和神经元在死亡后发生有效的再生，所以，促使病变的毛细胞和神经元尽快恢复或避免死亡，是感音神经性聋治疗的关键［10］。由于内耳特殊的生理解剖结构——血脑屏障和血迷路屏障的存在，目前还没有一种非常理想的载体应用于内耳基因治疗，因此，迫切需要开发一种安全、高效且具有组织特异性的内耳基因治疗载体。目前在基因治疗研究领域，基因载体系统主要分为病毒型载体和非病毒型载体两大类。

3.2.1 病毒型载体 Kawamoto等［12］经鼓阶钻孔途径用腺病毒成功地将Math1基因转染至Corti器的支持细胞及周围的非感觉上皮细胞。Ishimoto等［20］同样用腺病毒成功地将lacZ基因转染至Corti器的支持细胞；但钻孔部位周围的毛细胞受到损害，提示腺病毒可能存在一定的毒性。Lalwani等（1997）发现，用腺相关病毒（adeno－associated virus，AAV）介导报告基因绿色荧光蛋白（GFP）进行耳蜗转染后，耳蜗内螺旋神经节组织、螺旋缘、Corti器及前庭膜出现较强的绿色荧光。Iizuka等［21］用AAV携带报告基因（GFP）经鼓阶钻孔及圆窗膜注射途径转染耳蜗，发现除外毛细胞外几乎所有的耳蜗组织如内毛细胞、各种支持细胞及神经元等出现不同强度的绿色荧光表达。Pietola等［22］将慢病毒HOX－GFP及WOX－GFP经鼓阶注射转染CD－1小鼠后，分别在鼓阶及前庭阶的上皮细胞发现较强的绿色荧光表达。Derby等（1999）应用I型单纯疱疹病毒（herpes simplex type I virus，HSV－1）及狂犬病毒将大肠杆菌lacZ基因转染至豚鼠耳蜗，使耳蜗内包括Corti器细胞在内的许多细胞成功表达lacZ基因。Praetorius等［23］用HSV－1携带报告基因通过椭圆囊开窗的方法对内耳进行转染后，发现几乎所有的前庭神经元及耳蜗神经元被成功转染，并在转染后第5天基因表达最强。此外，王俊等［24］应用Bac－to－Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac－GFP后，体外转染新生大鼠耳蜗Corti器模型，并通过圆窗膜直接将重组病毒显微注射进入豚鼠内耳，结果显示在体外Bac－GFP联合丁酸钠可以高效转染毛细胞和螺旋神经节细胞，在体内杆状病毒可以有效转染螺旋神经节细胞。

目前，已经有多种病毒型基因载体被开发出来并应用于内耳基因治疗的实验研究中，但病毒载体存在着潜在的免疫原性、致瘤性、致炎症反应及细胞毒性等缺点，还没有一种病毒型载体能应用于内耳基因治疗的临床研究［2］。

3.2.2 非病毒型载体 相对于病毒型载体，非病毒型载体尽管转染效率较低，但其具有无致瘤性、无免疫原性、低毒或无毒性、同时运载量相对较大等诸多优点。近年来探索使用非病毒型载体向内耳进行基因转染成为研究热点。

Maeda等［25］用脂质体介导pGJB2（R75W）－eGFP通过圆窗膜途径成功转染耳蜗的内外柱细胞、外毛细胞、Claudius细胞以及螺旋缘及螺旋韧带细胞。蒋明等［21］报道通过阳离子脂质体携带构建的p EGFPC2－NT3转染小鼠耳蜗原代培养的螺旋神经节细胞，在基因转染后24 h在荧光显微镜下观察到胞体及轴突发出绿色荧光的螺旋神经节细胞。Noushi等［26］将藻酸盐颗粒装载NT3后置于豚鼠圆窗膜上或植入耳蜗鼓阶，28天后发现，这2种方法对耳蜗听神经元的退行性变和凋亡均有保护作用。由于阳离子脂质体和其他阳离子聚合物均存在潜在的细胞毒性且转染效率相对较低的问题，目前研究人员致力于通过改变其本身的化学结构及相关配体修饰，使之更好的满足实验及临床基因治疗的需要。

纳米基因载体是指载体粒径在纳米级（1～100 nm）范围内的非病毒载体，是近年发展的一种新型非病毒型载体。Kopke等［27］用经过表面处理的四氧化三铁纳米颗粒置入动物中耳，纳米颗粒在恒定的磁场作用下可穿过圆窗膜进入内耳，也可进入中耳黏膜内。Praetorius等［28］发现Cy3标记的硅纳米粒在经完整圆窗膜给药后，能顺利渗透过圆窗膜，在耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞、前庭毛细胞以及脑干组织中均被检测到。Zou等［29］应用以脂质体核心的纳米载体经完整圆窗膜给药后，发现该纳米顺利地通过圆窗膜到达螺旋神经节细胞、神经纤维及内耳其他细胞。羟基磷灰石纳米颗粒（hydroxyapatite nanoparticles，n HAT）作为一种新型无机纳米基因转运载体，自其研发以来一直受到基因治疗领域许多研究者的密切关注［11，12，30，31］，n HAT在生产上具有制备简单、储存方便的特点，且具有良好的生物相容性，几乎无细胞毒性，是一种较为理想的基因载体工具。蒋明［31］等发现n HAT介导NT3转染处于兴奋毒性损伤急性期的豚鼠病变耳蜗后，能有效阻止和部分逆转其听觉损害。

纳米载体具有非病毒型载体的多项优点，其粒径更小、毒性更低、生物相容性更佳，能穿过组织间隙并被细胞吸收，可通过人体最小的毛细血管和血脑屏障［32］。纳米颗粒可通过静电作用和共价结合使其能在表面结合DNA，同时能保护其表面的核酸不受核酸酶的降解，有效地延长作用时间［33］。而且，纳米颗粒在体内及细胞内外具有很好的稳定性，不易被降解及消化。纳米载体的这些特性使其在药物和基因输送方面具有许多优越性，用纳米材料作为基因治疗载体成为该领域的研究热点和趋势。

3.3 内耳基因治疗给药途径的研究现状 内耳器官作为精密的听觉和平衡器官，不宜反复施行创伤性手术；由于内耳存在血迷路屏障，全身给药往往疗效欠佳且副作用较大，同时一些大分子物质如生长因子和神经营养因子等难以通过血迷路屏障并输送到内耳靶部位而发挥其生物学作用。因此，探索一种安全有效的内耳基因转移方法是开展内耳基因治疗的重要前提之一。

目前在动物研究中多采用内耳局部给药方法进行基因转染治疗，经耳蜗鼓阶钻孔微量灌注［12，25，31］和经圆窗膜内耳微量注射［21，22，24，33，34］是常用的办法；同时也有研究者们尝试经圆窗膜渗透给药的方法［25，26，28，29，30～36］；此外还有经前庭阶［37］、中阶［20］、后半规管［38］、外半规管［39］、前庭开窗术［23］、内淋巴囊（yamasoba，1999）、脑脊液［10〛等转染途径。其中，除经圆窗膜渗透给药方法外，其他方法操作均较复杂，要求术者有较高的手术技巧，且可能造成手术部位局部的损伤，甚至有引起内耳感染导致全聋的风险，在很大程度上限制了其临床应用。因此，经圆窗膜渗透是向内耳基因转染的较为理想的途径。然而，由于圆窗膜解剖结构的变异，临床上有部分患者的圆窗膜外侧还可能存在圆窗龛膜或其他纤维组织和脂肪团，增加了经圆窗膜给药的难度。此外，目前圆窗膜给药剂量尚未定量及标准化，药物的渗透方式、释放速率及持续作用时间等尚未完全明确。

4 展望

目前限制基因治疗向临床应用推进的“瓶颈”是缺乏理想的基因载体。相对于病毒型载体而言，非病毒型载体尤其是纳米载体更安全，使得其在基因治疗领域展示出明显的优势，有可能成为在临床上基因治疗的载体；但各种非病毒纳米载体的转染效率都相对较低，达不到临床实用的要求。为了提高基因转染效率，很重要的一个研究方向就是提高载体的靶向性及其与组织细胞的亲和力。由于纳米粒子表面具有高度的可修饰性，因此纳米载体的转染率可通过对纳米颗粒的形态、粒径、表面修饰、加工条件等进行改良以及应用环境和给药途径的改善而得到大大地提高［11］。Wu等［35］用改良后的n HAT（经PEI表面修饰后的n HAT）介导重组质粒p EGFPC2－NT3经完整圆窗膜途径向内耳转染48小时后，发现椭圆囊及壶腹嵴周围支持细胞区域中几乎所有的暗细胞都出现EGFP的显著表达；球囊、椭圆囊及壶腹嵴的大量毛细胞也出现EGFP的明显表达，提示改良后的n HAT在内耳基因治疗中有较大应用前景。

近年来，国外有人制造出一种由病毒DNA序列和非病毒载体结构共同组成的复合型载体［41，42］，具有病毒和非病毒载体的优点，又避免了两者的缺点。甚至有研究者，用纳米颗粒携带目的基因后与细菌相连接，开发出一种细菌性基因载体系统，并在靶细胞中成功表达出目的基因［43］。这些复合型载体，也许是未来基因治疗载体的发展方向之一。

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（2012－06－11收稿）

（本文编辑 周涛）

10.3969/j.issn.1006－7299.2013.03.031

时间：2013－5－6 15：44

R764.3

A

1006－7299（2013）03－0311－05

* 教育部博士点基金（20110162110007）、国家自然科学基金（81170912，30772402）、湖南省自然科学基金（02JJY2050）联合资助

1 中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科（长沙 410008）； 2 耳鼻咽喉重大疾病研究湖南省重点实验室

孙虹（Email：shjhaj＠vip.163.com）

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20130506.1544.005.html