刺参耐寒基因筛选cDNA文库的构建与分析

李成泽，王晓燕，丁君，常亚青

(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连 116023）

刺参耐寒基因筛选cDNA文库的构建与分析

李成泽，王晓燕，丁君，常亚青

(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连 116023）

利用抑制性消减杂交 (Suppression subtractive hybridization，SSH）技术，对刺参Apostichopus japonicus耐低温性状相关的基因进行研究。通过对刺参进行低温骤降试验，利用SSH技术构建刺参低温骤降双向消减cDNA文库，共获得6 800个阳性克隆，从文库中随机挑取1 000个阳性克隆测序，共获得680条有效EST序列。利用Blastx软件将测序结果与GenBank数据库进行比对，结果显示:72个克隆与已知基因高度同源，其中有6个基因与应激和免疫反应相关，存在于正向文库的有4个，分别为铁蛋白、溶菌酶、类似紫海胆冷诱导β－RNA结合蛋白和huadl3021索转铁蛋白，存在于反向文库的有2个，分别为热休克同源蛋白70和热休克蛋白gp96;有3个基因与营养代谢和运输相关，且都存在于反向文库，分别为主要卵黄蛋白1、主要卵黄蛋白2和胰淀粉酶。研究表明，刺参低温骤降文库的成功构建对阐述其耐低温分子机制有非常重要的意义，为刺参育种和生物学研究提供了新的资料。

刺参;耐寒基因;抑制消减杂交

刺参Apostichopus japonicus又名仿刺参，隶属于棘皮动物门、海参纲、刺参科、仿刺参属，在中国主要产于辽宁、山东、河北等北太平洋沿海区域，现已成为中国北方沿海重要的养殖品种之一［1］。温度是影响刺参生存、生长发育和繁殖的重要环境因子之一，温度太高，刺参进入夏眠阶段，温度太低，刺参生长缓慢，严重时会出现化皮等现象［2］。目前，有关温度对刺参生理生态学影响的研究多集中在夏眠期阶段，董云伟等［3］对刺参温度适应性机制及夏眠过程中的生理机制进行了探讨;王方雨［4］研究认为，刺参体腔液内几种免疫酶类活性受升温胁迫影响显著。而对于在越冬期中的刺参受环境因子影响的研究报道较少，有研究发现，刺参在不同季节随着温度的变化，体内的超氧化物歧化酶 (SOD）、过氧化氢酶 (CAT）活性和GST、Hsp蛋白均呈现出显著的规律性变化。但仅用生理、生化理论不能解释刺参耐寒的根本作用机理。中国北方的渤海和黄海北部，冬季受西伯利亚南下寒潮的影响，每年都会出现不同程度的结冰，严重影响了北方沿海海参养殖业的发展，一些地区海参死亡率高达80%以上，存活的海参也出现了严重化皮现象。因此，在基因层面上研究刺参耐寒机理及分子调控机制显得尤为重要。

抑制性消减杂交 (Suppression subtractive hybridization，SSH）技术是近年来发展起来的筛选差异基因的一项新技术，该技术效率高、假阳性低，能够有效分离扩增低丰度差异表达的基因［5］。本研究中，作者利用SSH技术成功构建了刺参低温骤降双向消减cDNA文库，获得了刺参耐寒的相关基因，为刺参的育种和生物学研究提供了新的资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验刺参于2011年4月采自某养殖场，规格为50～60 g，暂养于大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，水温保持在 (10±1）℃，每天定时半量换水，盐度为31～32，正常通气喂食，试验前3d停止喂食。选择体态伸展、健康的20头刺参用于试验。

1.2 方法

1.2.1 低温处理 取10头刺参进行低温骤降试验，降温程序为10℃→8℃→6℃→4℃→2℃→0℃→－2℃，每降至一个梯度维持12 h，待温度降至－2℃时，维持12 h;另取10头刺参于常温(10℃）下养殖，作为对照。

1.2.2 刺参组织总RNA的提取和mRNA的分离纯化 从处理好的6头刺参中取体壁、肠、呼吸树和纵肌，用液氮瞬间冷冻，放于冰箱 (－80℃）中保存备用。用Trizol试剂 (Invitrogen公司）提取4种组织的总RNA，用FastTrackⓇMAG mRNA isolation Kit试剂盒 (Invitrogen公司）分离mRNA，将其混合后用紫外分光光度计 (Nano Drop 2000）检测总RNA和mRNA样品的浓度和纯度。

1.2.3 抑制性消减杂交 以低温骤降组为试验方(tester），以常温对照组为消减方 (driver）进行正向消减;以常温对照组为试验方 (tester），以低温骤降组为消减方 (driver）进行反向消减，具体步骤参照PCR－Select cDNA Subtraction试剂盒 (Clontech公司）说明书。分别将Tester和Driver mRNA用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit试剂盒(Clontech公司）反转录成双链cDNA，用RsaI充分酶切1.5 h后，将Tester cDNA平均分为两份，分别与 Adaptor1和 Adaptor2R连接，再分别与Driver cDNA进行第一次杂交，混合两种杂交产物，然后再与新变性的Driver cDNA进行第二次杂交。杂交产物以引物primer1进行第一次PCR扩增，将产物再用引物Nested primer1和2R进行第二次PCR扩增，使差异表达基因得到指数扩增。

1.2.4 双向消减cDNA文库的构建 将两次消减PCR扩增产物经Axygen PCR产物纯化试剂盒纯化后连接到pMD－18－T载体中，再转化至受态宿主菌 (DH－5α）中，用氨苄青霉素和蓝白斑法筛选阳性克隆。

1.2.5 消减效率的检测 以刺参内参基因β－actin为特异性引物:上游引物5'CGGGAAATCGTTCGTGACA 3'，下游引物5'AGGACAAAGTTGGCGTACA 3'，扩增未消减和消减后的 cDNA样品并利用Real－time PCR方法对其进行消减效率分析。反应程序为:94℃下预变性10 s;94℃下变性5 s，60℃下退火20 s，72℃下延伸30 s，共进行40个循环。

1.2.6 cDNA测序及EST序列分析 随机挑选阳性克隆送英潍捷基 (上海）贸易有限公司进行测序，利用Blastx软件对获得的有效 EST序列与GenBank数据库进行比对。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取及消减文库的构建

按照Trizol说明书提取的总RNA经紫外分光光度计检测 OD260nm/OD280nm，结果为1.8～2.0，说明RNA质量较高，没有DNA、蛋白或酚的污染。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，二者亮度比为2∶1至2.5∶1，条带整齐，说明RNA完整性较好。将从骤降组和对照组分离的mRNA用紫外分光光度计检测OD260nm/OD280nm，分别为1.89和2.09，质量分别为14.9 μg和4.5 μg，满足后续试验的需要。

2.2 消减杂交及差异片段阳性克隆的PCR检测

用CloneMiner II cDNA Library Construction Kit试剂盒 (Invitrogen公司）合成全长dscDNA，酶切后cDNA表现为平均大小为100～2 000 bp的条带，说明cDNA酶切较完全。从正反向文库中随机各挑取12个克隆对所建文库进行阳性克隆检测，结果如图1所示。PCR检测结果显示，阳性克隆片段主要集中在200～800 bp，文库中片段插入率为95%。

图1 消减文库部分克隆菌落PCR检测图Fig.1 Electrophoresis photograph of colony PCR of some clones in subtracted library

2.3 消减杂交效率的分析

图2 以β－actin基因为指标检测消减杂交效率Fig.2 Real－time PCR analysis of the subtractive hybridization efficiency by β－actin gene

利用 Real－time PCR方法，以刺参内参基因β－actin为特异性引物分别扩增未消减和消减后的tester cDNA样品。结果显示，相同PCR循环参数下，未经消减的cDNA在第16个循环处出现扩增 (图2－A），而消减后的cDNA在第36个循环处才出现扩增 (图2－B），差异表达基因被富集220倍，消减杂交效率较高。

2.4 低温骤降条件下刺参cDNA双向消减文库库容量及测序

试验得到刺参在低温骤降条件下cDNA正反向消减文库6 800个阳性克隆，从文库中挑取1 000个阳性克隆测序，共获得680条有效EST序列，其中正向485条，反向195条。统计结果如表1所示。

表1 刺参cDNA消减文库基本数据统计Tab.1 Basic data statistics of cDNA subtractive library in sea cucumber Apostichopus japonicus

利用Blastx对获得的有效EST序列与GenBank数据库进行比对，结果显示，有72个克隆与已知基因序列高度同源，其中正向文库46个，反向文库26个。

其中有6个基因与应激和免疫反应相关，存在于正向文库的有4个，分别为铁蛋白、溶菌酶、紫海胆类似冷诱导β－RNA结合蛋白和huadl3021索转铁蛋白，存在于反向文库的有2个，分别为热休克同源蛋白70和热休克蛋白gp96;有3个基因与营养代谢和运输相关，且都存在于反向文库，分别为主要卵黄蛋白1、主要卵黄蛋白2和草鱼胰淀粉酶。对已知功能基因进行GO注释 (http://geneontology.org/），进一步确定基因的功能。根据功能将已知基因分为6类:能量与基础代谢、信号转导、转录翻译、糖与蛋白代谢、应激反应和营养离子运输。部分基因功能分类结果见表2。

本研究中，还对文库中得到的有效EST序列进行KEGG数据库同源比对，发现文库中涉及到的主要代谢通路有:氧化磷酸化、转运RNA、肌动蛋白细胞骨架调节、淀粉与蔗糖代谢、钙信号途径、磷脂酰肌醇信号系统、磷酸肌醇代谢、蛋白质代谢和鞘脂类代谢等。

3 讨论

3.1 刺参低温骤降消减cDNA文库的成功构建

SSH技术是结合抑制PCR(suppression PCR）技术和消减杂交方法建立的一种寻找差异基因的方法。该技术在水产动物研究中的应用越来越广泛，梁利群等［6］利用 SSH技术研究了与鲤Cyprinus carpio抗寒性状相关的基因，成功构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库;Zhao等［7］用SSH技术筛选了刺参再生和高温胁迫过程中一系列差异表达的基因;王晓燕等［8］利用两种降温模式探讨了其对刺参免疫酶、可溶性蛋白和可溶性糖的影响，发现CAT和SOD的活性随温度的降低都产生了较为明显的变化，不同的降温幅度对可溶性糖和可溶性蛋白的含量有显著的影响。

生物机体对低温环境的适应是一个复杂的机体自身调节过程。刘伟等［9］探讨了低温对不同群体刺参体腔液中非特异性免疫酶CAT、SOD和过氧化物酶 (POD）活力的影响，发现“水院1号”刺参群体较大连养殖刺参群体对低温的反应更灵敏，保护机体免受氧化损伤的能力更强。此外，冷血动物调节细胞膜流动性机制表明，低温胁迫会增加膜磷脂的多不饱和脂肪来保持膜的流动性［10］。本研究中，笔者首次建立了刺参低温骤降cDNA文库，正反向消减文库共获得6 800个阳性克隆，680条有效EST序列，包括与刺参免疫、应激、营养代谢和运输等相关的基因，为解析低温条件下刺参生理、生化变化过程的分子机理，以及获得低温与刺参生理代谢的相关信息提供了坚实的分子依据。

3.2 正向和反向cDNA文库基因分析

本研究中构建的刺参耐寒正向cDNA文库及上调表达的基因有铁蛋白 (ferritin）、转铁蛋白(Transferrin，又称为铁传递蛋白、运铁蛋白）、溶菌酶、类似海胆冷诱导β－RNA结合蛋白。

铁蛋白广泛存在于动植物和微生物体内，是一种铁储存和生物矿化蛋白，它的表达调控可以维持机体内的铁平衡［11］。铁蛋白也是细胞抵抗应激和炎症的一种蛋白，在机体免疫中起着一定的作用。有研究表明，在刺参胚胎发生、个体发育的各个阶段，以及幼参肠道、体腔细胞、呼吸树和体壁各组织中均有铁蛋白表达［12］。

转铁蛋白是机体铁的运输者，已有研究证实，淡水养殖鱼类转铁蛋白具有耐低氧的特性，并与栖息水层有密切关系［13］。转铁蛋白在抗菌、杀菌和调控细胞的增殖、分化与凋亡过程中发挥重要作用。本研究中，刺参在低温环境下铁蛋白和转铁蛋白上调表达，推测其原因是机体为应对低温胁迫需要更多铁蛋白维持机体正常生长和代谢。

溶菌酶是水产动物抵御病原菌的一种非常重要的先天性免疫防御蛋白［14］，它是一类微小的普遍存在的抗菌酶，能够催化分解N－乙酰胞壁酸和N－乙酰葡糖胺的 β－1，4－糖苷键，导致溶菌作用。温度变化会显著影响刺参体腔液中溶菌酶的活性，以维持机体保持正常生活状态。本研究中，低温胁迫引起溶菌酶上调表达，以使机体适应外界低温环境。

本研究中，在正向cDNA文库中还发现了一个与紫海胆冷诱导RNA结合蛋白 (CIRP）高度同源的蛋白。CIRP最初是从小鼠的睾丸细胞中被分离鉴定的，CIRP具有介导冷诱导的细胞生长抑制作用［15］。目前，研究者已从小鼠、人类、非洲爪蟾、鲑鱼和紫海胆等多种生物细胞中分离出了CIRP的cDNA。其不仅参与人和动物冷应激过程，而且可能参与人和动物渗透应激、缺氧应激、胚胎发育、肿瘤发生，以及动物冬眠等多种生理过程［16］。

本研究中，反向cDNA文库及下调表达的基因有刺参热休克同源蛋白70和热休克蛋白gp96、刺参主要卵黄蛋白1、刺参主要卵黄蛋白2和胰淀粉酶。

热休克蛋白 (Heat shock protein，Hsp）作为分子伴侣，在应对极高或极低温度、低氧、氧化自由基、重金属和细菌感染过程中，机体产生可诱导热休克蛋白，能修复变性蛋白质，加快恢复正常蛋白的形成，并且Hsp具有免疫调节和提高免疫细胞识别病原体的作用［17］。目前，在水产领域中研究Hsp与温度耐受性方面的报道较多，Dong等［18］对刺参分别进行高温和渗透压胁迫的研究表明，刺参Hsp70基因均上调表达。也有研究表明，随着温度骤升和骤降，Hsp70表达量表现为先增加后降低的趋势［19］。

热休克同源蛋白 70(Heat shock cognate，Hsc70）作为Hsp70家族的成员，也具有Hsp70增强机体耐受性的能力［20－21］，本研究中首次发现，在低温环境下刺参Hsc70和gp96下调表达，推测是由于刺参在耐寒胁迫过程中已经产生了大量Hsc70应对低温环境，不需要一直过量表达，而且过量表达会产生一些负作用［22］，会减少或者延缓生长和细胞分裂，降低繁殖能力，因此表现为下调表达。

主要卵黄蛋白 (major yolk protein，MYP）是存在于海胆卵中最丰富的一种蛋白，经比对发现，海胆MYP的cDNA序列与一些铁传递家族蛋白具有较高同源性［23］。Fujiwara等［24］于 2010 年克隆了日本刺参MYP，其与海胆MYP具有30%同源性，将其分为AjMYP1和AjMYP2，并且发现这两种MYP在刺参各个组织和器官中均有表达，是运输蛋白。本研究中，刺参两种MYPs在低温环境下下调表达，推测其原因是刺参在低温环境下进入类似“冬眠”时期，活动能力减弱，不需运输过多营养物质，因此，MYPs作为运输蛋白表现为下调表达。

淀粉酶是刺参的主要消化酶，刺参消化道中均能检测到淀粉酶活性［25］。胰淀粉酶作为刺参主要消化酶在低温环境下表现为下调表达，说明刺参代谢耗能过程减缓。

本研究结果表明，低温骤降双向消减cDNA文库中均涉及到较多的免疫、应激和营养运输相关的基因，这些功能基因编码的产物有结构蛋白、生物调节蛋白、酶、抑制剂、受体等，参与多个代谢和信号通路。笔者将继续用各种降温模式胁迫刺参，并以此为切入点对刺参不同组织内基因表达量进行研究，以期从基因层面上阐释刺参应答低温胁迫的复杂机制。

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Construction and analysis of subtracted cDNA library of sea cucumberApostichopus japonicusunder low temperature stress

LI Cheng－ze，WANG Xiao－yan，DING Jun，CHANG Ya－qing
(Key Laboratory of Mariculture＆ Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Suppression subtractive hybridization(SSH）was used to analyze the differences in expression of genes related to low temperature resistance in sea cucumberApostichopus japonicus，induced by low temperature，in order to understand the molecular response.A total of 6 800 clones was obtained in the forward and reverse library of the sea cucumber exposed to the sharp decrease in temperature.Among the clones，1 000 clones was selected and analyzed，and 680 distinct EST sequences were obtained，with 72 clones sharing similarity to the sequences in Genbank databases by Blaster.There were 6 genes related to the stress and immune response，including 4 of ferritin，lysozyme，similar to cold inducible RNA－binding protein beta，and isolate huadl3021 melanotransferrin mRNA in the forward library and the other 2 of heat shock cognate 70，heat shock protein gp96 in the reverse library.There were 3 genes related to nutrition in the reverse library，including major yolk protein 1，major yolk protein 2 and pancreatic amylase.The findings suggest that cold stress have significant effects on gene expression，and provide the basis for further study of molecular regulation mechanisms underlying the response to cold in sea cucumber.

Apostichopus japonicus;gene for cold temperature stress;suppression subtractive hybridization

S917.4

A

2095－1388(2013）06－0522－06

2013－03－21

国家自然科学基金资助项目 (31072230）;国家海洋局海洋公益项目 (201105016－3）;辽宁省重大科技专项 (2011203003）;国家“863”计划重大项目 (2012AA10A412）

李成泽 (1988－），女，硕士研究生。E－mail:chengze8023@163.com

常亚青 (1967－），男，教授。E－mail:yqchang@dlou.edu.cn