全血细胞减少性疾病的染色体培养

刘文刚 罗明霞

全血细胞减少（Pancytopenia，PCP）是指外周血中的三种有形成份红细胞、白细胞、血小板均低于正常值，是各种疾病造成的一种外周血象的改变[1]。多种疾病外周血可呈全血细胞减少，临床主要表现为贫血、出血、感染。全血细胞减少症不是一个独立的疾病，它是一组高度异质性疾病在某一侧面的共同表现。按病理生理的不同全血细胞减少可分为由造血系统引起的全血细胞减少和非造血系统疾病引起的全血细胞减少，造血系统引起的全血细胞减少常见于再生障碍性贫血（AA）、低增生性白血病、恶性组织细胞病（恶组）、骨髓纤维化、脾功能亢进、骨髓增生异常综合征（MDS）、多发性骨髓瘤（MM），非造血系统疾病引起的全血细胞减少常见于淋巴瘤、阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）、血栓性血小板减少性紫癜、骨髓转移癌等。骨髓生成障碍可进一步分为非克隆增殖性疾病与克隆增殖性疾[2]。全血细胞减少性疾病临床并不少见，常见于血液病，亦可见于其他疾病，因涉及疾病甚多，其诊断难在病因学诊断，应结合临床、血象、骨髓象、染色体等相关检查对全血细胞减少性疾病做出诊断。

目前，制备骨髓细胞染色体的方法主要有直接法、短期培养法和同步法。同步法操作技术要求高、分裂指数低，不易推广[3]。随着荧光原位杂交技术（FISH）及基因组杂交技术的应用于临床研究，拓展了染色体的检查范围，提高了识别异常染色体的能力，但因荧光试剂和检测设备昂贵难易广泛应用于临床。笔者介绍一种改良的染色体培养方法，应用在培养体系中加入G-CSF的方法对480例全血细胞减少性疾病进行骨髓染色体检查，获得了满意的结果。人们认为在正常情况下为维持生理平衡，有骨髓基质细胞产生极少量的G-CSF，诱导粒细胞的分化和增殖；G-CSF的作用点：G-CSF是通过靶细胞膜上的受体实现作用的，其作用点有两个：（1）作用于全向造血干细胞使之从静止期进入增殖期（G0-G1）；（2）特异性地作用于粒系祖细胞CFU-G促进其增殖分化，同时作用于整个粒系：CFU-G （外周血）中性粒细胞；促进增殖分化，功能加强。

1 资料与方法

1.1 一般资料 480例全血细胞减少性疾病均为2003年1月-2011年12月笔者所在医院血液科门诊及住院的患者，全部为初诊患者。根据患者的临床表现、血象、骨髓象、细胞化学、骨髓细胞染色体等检查结果确定诊断。其中再生障碍性贫血（AA）202例，骨髓增生异常综合症（MDS）147例，低增生性白血病85例，巨幼细胞性贫血21例，多发性骨髓瘤（MM）10例，恶性组织性疾病9例，骨髓纤维化6例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 用肝素抗凝无菌骨髓3~5 ml。

1.2.2 培养体系的配制 按常规方法配制骨髓染色体培养液[4]。1号为瓶1640液8 ml+胎牛血清2 ml，2号为瓶1640液8 ml+胎牛血清2 ml并加入20 U/ml的GM-CSF，培养体系随用随配。

1.2.3 短期培养法 将采集的骨髓注入培养体系中，按（3~8）×106/ml细胞密度接种到培养体系中，每位患者接种2瓶。1号瓶为普通的培养体系，2号瓶为加入了20 U/ml的GM-CSF的培养体系。置37 ℃ 5% CO2培养箱中培养24 h，终止前2 h加入浓度为5 μg/ml的秋水仙碱0.2 ml，2 h后将骨髓培养液移入10 ml的离心管内1000 r/min，离心10 min，弃上清后收获细胞。

1.2.4 低渗处理 收获细胞后加入预温至37 ℃的0.075 mol/L的 KCL 8 ml，轻轻混匀后置37 ℃水浴箱内30 min，中间吹打混匀一次。

1.2.5 预固定与离心 低渗完毕后，直接加入新鲜配制的固定液甲醇：冰醋酸（3：1）1 ml，轻轻打匀，立即离心，1000 r/min、离心10 min。

1.2.6 固定与离心 加固定液8 ml，混匀，室温静止10 min，1000 r/min、离心10 min。

1.2.7 二次固定与离心 同（1.2.5），离心完置4 ℃冰箱过夜，次日滴片。

1.2.8 滴片与烤片 制成细胞悬液并滴片，滴片后在40烤片机上烘干，之后放置80 ℃左右的烤片机上烘烤4 h，室温放置2 d后做带。

1.2.9 G显带 2.5%胰酶0.5 ml加入到50 ml的Hank’S液中置37 ℃水浴箱中，15 min后作带，将老化的标本在胰酶中作用15~25 s，姬姆萨染色5 min，水洗。

1.3 染色体核心型分析 染色体分析的方法包括镜下分析、照相分析和电脑分析等三种，以镜下分析最为常用。按《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）》进行染色体核行分析。至少2个细胞有同样的染色体增加或结构重排，或者3个细胞有相同的染色体丢失，方可确认为一个异常克隆。一般情况下分析20~30个中期细胞即可，如果发现一种或数种异常细胞，则必须增加分析细胞数。

2 结果

480例全血细胞减少性疾病采用上述方法制备骨髓细胞染色体培养，1号瓶培养结果439例（91.5%）获得成功，41例培养失败。2号瓶培养结果480例（100%）全部培养成功。

3 讨论

全血细胞减少性疾病的染色体制备，往往分裂相指数低，显带效果差，难以广泛开展。建立稳定的培养、制备、显带方法是提高染色体检查成功率和异常检出率的关键，加入集落刺激因子可以促进骨髓细胞的分裂增殖，获得较多的中期分列相，笔者对加入G-CSF培养体系对480例全血细胞减少性疾病的骨髓染色体检查中，无一例失败全部培养成功，较单一采用直接法或短期培养法成功率高。笔者认为可以推广，以提高工作效率，可为细胞遗传学实验工作参考。

[1] 于华，刘小信，张忠芳.全血细胞减少性疾病的鉴别诊断[J].齐鲁医学检验，2005，16（1）：64.

[2] 余润泉.全血细胞减少症的鉴别诊断[J].中华内科杂志，2004，10（10）：790-792.

[3] 林梓家，闫桂兰，张金鹏.即刻低渗法在恶性血液病骨髓染色体制备中的应用[J].中华医学遗传学杂志，1998，15（5）：325-326.

[4] 薛永权.白血病细胞遗传学及图谱[M].天津：天津科学技术出版社，2003：106.