钙蛋白酶抑制剂对大鼠脑外伤后的神经保护作用分析

王勇朝 崔颖 崔建忠 张娟

钙蛋白酶抑制剂对大鼠脑外伤后的神经保护作用分析

王勇朝 崔颖 崔建忠 张娟

目的 分析钙蛋白酶抑制剂对大鼠脑外伤后神经的保护作用。方法 选取56只大鼠并进行分组，脑外伤后分别注射钙蛋白酶抑制剂和生理盐水，分析细胞凋亡情况。结果 观察组的神经元凋亡比对照组少。结论 钙蛋白酶抑制剂对脑外伤后的大鼠具有良好的神经保护作用。

钙蛋白酶抑制剂；脑外伤大鼠；神经保护；凋亡

脑外伤是一种由于间接或直接作用, 使脑部出现损伤的情况。比较常见的脑外伤有颅骨骨折、头皮裂伤、颅内血肿、脑震荡等［1］。受伤后伤者会出现不同程度的意识模糊、呕吐、头痛、运动障碍等情况。颅脑损伤后脑细胞常出现凋亡的情况, 这与继发性脑损伤的严重程度有密切关系。钙蛋白酶作为脑外伤继发性损伤中的重要组成因素之一, 通过激活caspase系统可能会对脑外伤继发性损伤具有一定的保护作用。现采用大鼠实验的方法进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取56只2～3个月大的健康SD大鼠作为研究对象, 所有大鼠的重量为255～290g之间, 其中雌性大鼠20例, 雄性大鼠26例。将其随机分为观察组和对照组, 每组28例。

1.2 方法 先给予所有大鼠注射250 mg/kg水合氯醛(10%),然后给予观察组28例大鼠的侧脑室注射10 μl钙蛋白酶抑制剂, 给予对照组28例大鼠的侧脑室注射10 μl生理盐水。按照不同的处死时间点将每组各分为四个小组, 每小组为7例：0.5 h组、6 h组、24 h组以及3 d组。次日, 利用自由落体撞击方式制造大鼠脑外伤(撞击的高度为1.6 m,重量为55 g)。在各处死点观察和记录大鼠神经功能的缺失症状。

1.3 TUNEL检测法检测凋亡 使用多聚甲醛(4%)和生理盐水快速灌注大鼠, 然后将大鼠的整个脑组织取出, 并将软脑膜剥离完全。将取出的脑组织侵泡于多聚甲醛(4%)中约4 h,然后再将其捞出侵泡于5℃的蔗糖溶液(30%)中约2 d时间［2］。将固定后的脑组织进行冰冻切片(厚20 μm), 并在TUNEL试剂盒中进行苏木素染色。最后使用400倍的光镜观察并记录阳性细胞数。

1.4 统计学方法 数据的统计分析使用SPSS11.5软件, 数据使用均数( x-±s)表示, 并使用t检验, 以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

TUNEL法检测结果显示两组大鼠的海马区存在不同数量的TUNEL染色阳性的凋亡细胞。观察组中, 0.5 h组为(54±2.9)个、6h组为(56±1.0)个、24h组为 (59±2.2)个、3d组为 (66±3.1)个；而对照组相中, 0.5h组为( 66±2.4)个、6h组为( 64±1.4)个、24h组为 (68±5.6)个、3d组为 (74±2.9)个。可见, 观察组的TUNEL阳性的凋亡细胞在不同的处死点均比对照组少, P＜0.05,差异具有统计学意义。

3 讨论

Calpain系统是一种比较复杂的蛋白降解体系, 其主要的作用对象是受体蛋白、蛋白激酶、细胞骨架蛋白。通过对其进行降解, 从而将细胞分解, 使其引起凋亡。因此, Calpain的活化成为细胞凋亡的主要途径。通过本次大鼠实验研究, 总结钙蛋白酶诱发细胞凋亡的可能原因有以下两点：①启动了Caspases介导的细胞凋亡；②Ca2+的释出起到诱导死亡受体配体表达的作用。研究中, 给予观察组脑损伤大鼠钙蛋白酶抑制剂治疗, 在大鼠脑外伤0.5 h能检测到大鼠的凋亡细胞, 且凋亡细胞的数量呈逐渐上升的趋势, 在第3 d时达到高峰, 这也与其他文献资料中的研究结果相一致。出现此种现象的原因可能是：使用钙蛋白酶抑制剂治疗大鼠属于一次性注射治疗, 在大鼠体内的作用有限, 因此, 能在短时间内检测到该药物对细胞凋亡的影响作用。为此, 推测3d后再进行TUNEL法检测, 由于药物在大鼠体内的代谢降解作用, 浓度越来越小, 可能难以抑制钙蛋白酶, 无法阻止细胞凋亡的进度。不过对于具体的有效时间目前仍需进一步实验研究。通过本次研究, 证明钙蛋白酶抑制剂对脑外伤后的大鼠具有一定的保护作用。从而能在一定程度上减少脑外伤后神经细胞继发性损伤, 这对于钙蛋白酶抑制剂用于治疗人类的脑外伤具有十分重要的意义。

［1］ 杨瑞,罗承良,孙玉霞,等.E64d对创伤性脑损伤小鼠神经细胞的保护作用.苏州大学学报(医学版), 2011,31(2):183-187.

［2］ 丁可,王汉东,成慧琳,等.创伤性脑损伤后小鼠肠道Toll样受体4的表达.肠外与肠内营养, 2010,17(04):243-246.

063000 唐山,河北联合大学基础医学院(王勇朝张娟)；唐山市工人医院神经外科(崔颖 崔建忠)

高俊玲