细胞因子诱导的杀伤细胞治疗癌症的基础与临床

王志华

1.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院，黑龙江哈尔滨 150081；2.合肥凤凰肿瘤医院生物免疫治疗中心，安徽合肥 230001

过继性细胞免疫治疗（adoptive immunotherapy，AIT）是指通过输注自身或同种特异性或非特异性“抗肿瘤免疫效应细胞”直接杀伤肿瘤细胞或纠正机体低下的细胞免疫功能来达到治疗肿瘤的目的。伴随细胞生物学，分子免疫学及生物工程技术的发展及相互交叉渗透，细胞介导的过继免疫治疗发展迅速，已成为肿瘤手术、放化疗后进行综合治疗的手段之一。有研究人员报道了具有高增殖能力和高细胞毒性的多种细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced kill cell，CIK），由4 种细胞因子活化，具有比淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）细胞更强的肿瘤杀伤活性[1-3]。在血液系统疾病，恶性肿瘤临床治疗中表现出明显优于其他过继性免疫治疗手段的强大优势，因而被越来越广泛地被应用到临床过继免疫治疗中。目前国内外有关CIK 细胞的研究日趋活跃，笔者仅就近年来国内外CIK 细胞治疗恶性肿瘤的基础和应用研究做以简要推介，期望对从事此领域的同行有所借鉴及帮助。

1 CIK的表型及膜标志

CIK 细胞主要存在于外周血和肝脏，而以后者分布较多，外周血淋巴细胞中可找到大量的CIK 前体细胞。研究证实，CIK 细胞是一种异质细胞，是一个混合的细胞群体。CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞是其主要成分[4]。主要的效应细胞是CD3+CD56+细胞。Negrin等[5]证明诱导扩增出来的CD3+CD56+细胞来源于CD3+CD56 T 细胞，而不是CD3CD56+自然杀伤细胞或体内原来就存在的CD3+CD56+细胞。虽然就单位细胞的细胞毒性而言最强的是CD3CD56+NK 细胞亚群，不过此亚群所占比例小（＜5%），对整体细胞毒性贡献不大[6]。

研究还发现虽然CD3+CD56+细胞在外周血淋巴细胞中仅含1%～5%，然而该细胞可在一定的培养条件下迅速扩增，一般情况下在有经验的实验室体外培养20 d 左右增长数量可达1 000倍以上，而且在回输体内后在IL-2 存在的情况下仍可进一步增生繁殖。在CIK 细胞的培养过程中，CD3+细胞，即T 细胞得到了优先增生，非T 细胞渐被淘汰。这点可通过流式细胞仪细胞表面标志分析得到验证。根据上述研究获得的大量具有活性的CIK 细胞为临床进行肿瘤免疫治疗提供了充足的数量保证。

2 CIK 作用机制

CIK 细胞回输到患者体内后可特异性地聚集于肿瘤局部发挥抗肿瘤作用。研究发现CD56 抗原可能是CIK 细胞中起增强细胞毒性作用的重要抗原。目前认为CIK 细胞的抗肿瘤作用机制可能有以下几种：①当CIK 细胞被激活时，通过免疫球蛋白Fc 受体（FcR）使淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）和ICAM-1的结合从低亲和力转为高亲和力，并向细胞间排出含有氮-甲苯碳酰基-左旋-赖氨酸硫甲苯酯（BLT）的胞浆毒性颗粒[7]，其高表达引发胞浆毒性颗粒依赖性溶细胞作用，致靶细胞死亡。②CIK 细胞也可因表面CD3 受体结合而激活，CD3 与 TCR 或TCRγ 结合，参与信息传递，导致胞浆毒性颗粒释放而产生溶瘤作用。③CIK 细胞自身能分泌白细胞介素2（IL-2）、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等细胞因子，这些因子在较高浓度下可单独杀伤靶细胞及提高效应细胞毒性[8-9]。④CIK 细胞也可诱导肿瘤细胞凋亡，因CIK 细胞能活化肿瘤细胞凋亡基因[10-11]，使得FLIP、Bcl-2、Bcl-xL、DAD1 和Survivin 基因表达上调。⑤应用氧化酶免疫染色法，发现CD3+CD56+CIK 细胞能分泌穿孔蛋白（PFP），该蛋白与靶细胞溶解有关[12]。CD3+CD56+的双阳性表达为杀伤功能提供了进一步的物质基础。

3 用于临床治疗的CIK 细胞来源

CIK 细胞可以来自不同的组织，自体和异体外周血、脐带血或骨髓等。临床治疗时应根据患者的实际情况选择合适的采集方法，以获得最好的治疗效果。

3.1 脐血来源的CIK

脐血来源广泛、采取方便、免疫原性弱，同时富含造血干细胞和单核细胞，而且脐血CD34+细胞较骨髓和外周血CD34+细胞含量更高、更纯、具有更强的增殖潜力。使用脐血作为研究对象，结果表明经培养后，脐血单个核细胞迅速扩增，其CD3+CD56+（CIK的主要效应细胞）扩增900倍以上，且CD3+CD8+的Ts 细胞明显增加，CD3+CD16+CD56+细胞亦明显增加[13]，这些都说明了脐血可以培养为 CIK 细胞，且扩增潜力极强。该研究还表明脐血CIK 细胞对白血病细胞株及原代白血病细胞有很强的细胞毒活性，其抗瘤作用主要是通过 CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD3+CD16+CD56+细胞来实现。脐血CIK 细胞在整个过程中扩增速度都快于外周血CIK 细胞，原因如下：①脐血中CIK 前体细胞含量高；②脐血中的淋巴细胞的绝对值较高，具有较强的增殖潜力[14]；③脐血淋巴细胞对CD3MAb 有较好的反应性，脐血一旦活化能很快产生非特异性NK 细胞样机制，而且CMNC 比PMNC 更易诱导出CIK 细胞活性，较易溶解肿瘤细胞。脐带血CIK 前体细胞含量相对较高，因此其杀伤活性高于外周血CIK 细胞[15-17]。综合上述论点可以认为来源于脐血的CIK 细胞较来源于外周血的CIK 细胞更适合用于临床治疗。

3.2 自体来源的CIK

大量的研究资料表明恶性肿瘤患者存在不同程度的免疫功能受损CD3+、CD4+、CD8+降低。用患者自体的CIK细胞经体外扩增回输，安全性得到极大提高，避免由于交叉感染引发其他疾病。目前流行的“用自己的细胞治疗自己的病”即指的此种方法。患者回输CIK后外周血免疫标志物 CD3+、CD4+、CD8+、CD3+CD56+均较回输前大幅上升（平均上升 25%～55%）。

杨琨等[18]用自身CIK 细胞过继性输注治疗38例肿瘤患者。结果显示：患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞都较治疗前明显提高。说明CIK 细胞输注治疗能有效地提高肿瘤患者的细胞免疫功能，并能有效地提高其机体的对肿瘤细胞的杀伤能力。Schmidt-Wolf等[19]应用肿瘤患者的外周血淋巴细胞诱导CIK 细胞，治疗期间，血清干扰素（IFN）、GM-CSF 及 TNF水平明显增加且患者外周血中CD3+淋巴细胞比例增高。

值得提醒的是，在临床治疗需要采集患者自体外周血诱导CIK 细胞时要提前对患者的血液成分、肿瘤大小、临床分级、生化指标、免疫功能、身体状态提前进行评估，做到心中有数，对于贫血的患者，要谨慎对待，尽量不采其本人的血，或采血后尽快给予输血，保证足够血容量；放化疗后的患者要预留充分的恢复期；因贫血或放化疗等原因可引起CIK 活化或扩增不佳。怀疑有血行转移或淋巴管转移的患者应注意诱导和扩增时间应足够长（据了解国内有个别单位只培养2～3 d 就回输的，这是一种极不规范和不负责任的做法，在这么短的时间内CIK 细胞只是对体外环境的适应过程，根本没有达到真正意义上的扩增），特别回输前要认真观察细胞状态和生长情况，排除有肿瘤细胞混入的可能性，杜绝在回输时造成人为血行转移的事故发生。

3.3 骨髓来源的CIK

长期骨髓培养（LTBMC）可选择性净化慢性髓性白血病（CML）患者的Ph+前体细胞，同时保留正常造血干/祖细胞。骨髓来源的CIK 细胞增殖能力较外周血来源的CIK 细胞稍差，但在细胞毒方面与外周血CIK 细胞相比无显著性差异。童春容等[20]提取CML 患者骨髓中的单个核细胞诱导CIK 细胞，观察CIK 细胞与LTBMC 联合对患者Ph+细胞的净化作用，期望建立一种既有体外净化作用，又有体内抗CML 效应的净化体系，以克服自体造血干细胞移植容易复发的缺陷。实验表明CML 患者的骨髓细胞在LTBMC 体系中培养7～9 d后再加入CIK 细胞+IL-2，对CML 患者Ph+细胞的净化作用明显比单纯LTBMC 强，在统计学上有显著性差异；从结果来看，CIK 细胞+IL-2 也比LAK 细胞+IL-2或IL-2 活化的骨髓细胞强；CIK 细胞+IL-2 处理共8例，6例患者Ph+在21%以下，其中4例在6%以下、2例为0。Linn等[21]从急性粒细胞白血病采集的骨髓样本中诱导CIK细胞，结果提示获得的CIK 细胞在活化、扩增及杀伤靶细胞方面没有大的影响。

3.4 同种异体来源的CIK

各种致癌因子作用机体使得免疫力下降是导致癌症发生的原因之一，研究证实肿瘤患者都不同程度地存在免疫耐受的情况。而越是中晚期的患者免疫状态下降越严重。另外术后恢复期和放化疗患者其CIK的扩增都相对较差。此种情况下应用同种异体CIK 细胞代替患者自身CIK则成了解决这一问题的途径之一。有两点值得注意：一是供者需是来自地方中心血站健康献血员同型血细胞；二是选用采集时间和储存时间短，尽可能新鲜的血细胞。本课题组在临床上遇到必须用同种异体来源CIK的时候往往采集患者直系亲属（父母，兄弟姐妹或子女），同型血的献血者，因为这样的献血者和受者的遗传指标相对接近，血型相同，相对较为安全可靠。而且无论在活化还是扩增方面比来自患者本身的明显优越。

综上所述，前面提及的4 种CIK 都可作为CIK 前体细胞来源进行采集和培养，治疗前应根据实验室的具体情况，培养经验，特别是受治患者和家属的意愿选择适当的采集方式。

4 多种细胞因子在CIK 培养中的作用

4.1 植物血凝素

秦福丽等[22]先用PHA 刺激24 h后再用传统培养方法继续培养至15 d 诱导出PHA-CIK 细胞，并将此细胞与自体血浆培养的CIK 细胞加以比较，结果发现各亚群细胞均得到增殖，尤其是CD3+CD8+增殖的最明显。这可能与PHA选择性地促进CD3+、CD8+细胞扩增有关。PHA-CIK 细胞中CD3+、CD8+、CD3+CD8+细胞所占的比例大，CD3+CD56+细胞明显增多（健康人外周血中CD3+CD56+细胞＜1%）。另外，PHA-CIK 细胞对不同的肿瘤细胞的杀伤能力有所不同。这可能与肿瘤细胞的免疫逃避机制不同有关。

4.2 细胞因子对CIK 细胞增殖和杀伤作用的影响

已有的研究均显示IL-2、IL-7、IL-15对维持杀伤细胞的细胞毒活性起重要作用[23-24]，SCF 可以协同IL-2的细胞增殖作用及增强对IL-2R的刺激效应，而FLT3L 和IL-15协同较单独应用IL-15 显著增加来自CD34+细胞的NK 细胞数量，而且可以增加CD34+HSC 上IL-2/IL-15R的表达，Braun等[25]的研究证实培养体系中含SCF 可以增强淋巴因子激活杀伤细胞对急性髓系白血病细胞的杀伤活性。黎阳等[26]在IL-2+IL-7+IL-15组合基础上分别添加SCF 和SCF+FLT3L，结果显示单加SCF 会减少CD3+CD56+CIK 细胞产率；联合使用SCF、FLT3L对同时扩增CD3+CD56+CIK有所帮助，CD3+CD56+CIK 细胞比例及培养体系细胞扩增倍数均显著增高。因此认为SCF+FLT3L+IL-2+IL-7+IL-15作为脐血-CIK 细胞杀伤诱导体系的细胞因子组合是合适的。最新的研究报道提示IL-15 可有效地扩增培养的CIK细胞，在治疗急性髓系白血病和横纹肌肉瘤方面取得令人鼓舞的效果[27]。

IL-12对 CIK 细胞的促增殖作用略低于IL-2，其诱导产生CD3+CD56+CIK 细胞的能力与IL-2的诱导能力无差别；联合IL-12 与IL-2 则可以扩增较高比例的CD3+CD56+CIK 细胞，而且CIK 细胞总数也有显著增高。这说明IL-12 同IL-2 一样可以诱导CIK 细胞的增殖，而联合二者有协同作用， 另外用IL-2 和IL-12 共同活化CIK 细胞时适当减少各自的用量亦可减少相应的毒副作用[28]。

4.3 胸腺球蛋白对CIK 细胞扩增的影响

近来，有报道认为胸腺球蛋白（Thymoglobulin，TG；Genzyme，MA，USA），一种通过兔抗人胸腺细胞而获得的，精制的IgG多克隆抗体，可以取代CD3 单克隆抗体和IFN、IL-2 结合，达到更有效地扩增CIK 细胞的目的。研究者还评估了用TG 活化的CIK 细胞杀伤靶细胞的能力，证明该细胞可更有效地杀伤K562 瘤细胞并能产生大量的具有生物活性的IL-12p40[29]。在诱导CIK 过程中加入IL-24对增殖活性有一定的影响，对细胞表型并无影响但明显增加了 CIK 细胞的杀伤活性，10∶1、20∶1 和 40∶1 效靶比对肿瘤细胞杀伤率均达到90%以上。这可能与IL-24对肿瘤细胞具有杀伤力而且IL-24 刺激的外周血单个核细胞48 h后有 IL-6、TNF-α 和IFN-γ的高表达，同时 IL-1β、IL-12和GM-CSF 也有一定水平的表达有关[30]。

5 CIK 与树突状细胞（DC）细胞共培养

为了提高治疗效果，很多实验室采用DC 和CIK 细胞共同培养，此举能刺激CIK 细胞毒活性显著增强[31]。DC 与CIK 细胞共培养后对肿瘤细胞的细胞毒活性增强，混合培养24 h后IL-12的分泌量为CIK 细胞单独培养时的6.93倍。DC的抗原提呈作用能使CIK 细胞分泌IFN-γ的时间延长，分泌量增加。两种细胞上清液中 IL-12、IFN-γ分泌量增加，且 CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞显著增多[32-33]。过去一段时间国际上把DC 细胞作为肿瘤疫苗的开发研究争相开展[34]。近两年以加拿大学者斯坦曼被推荐和获得诺贝尔医学奖为契机，国内外以DC 细胞治疗肿瘤的临床实验逐渐增多起来[35-38]，由此可以预言今后将DC 和CIK 细胞共培养并进行联合治疗将是肿瘤生物治疗新的发展目标和发展方向。

6 CIK的临床应用

6.1 治疗方案

参照卫生部《人体细胞治疗临床研究质控要点》和中国免疫学会制订的《过继性免疫治疗癌症规范》，其中规定每例患者平均治疗2个疗程，每个疗程回输细胞总数＞5 ×109个。为保证治疗效果，本治疗中心实行更为严格的质控标准。输入前3 d 必须进行细菌、真菌和支原体检测、细胞表型测定、MTT 试验和体外杀伤活性等测定。活细胞必须占到全部培养细胞的99%（活率）以上，每次输入细胞数量达到或超过 2 ×109个，每个疗程达到或超过（1.0～1.5）×1010个，以此确保治疗的安全性及有效性。

6.2 抗肿瘤作用

CIK 细胞对于微小残留白血病和白血病患者合并丙型肝炎的治疗具有良好的疗效。德国洪堡（Humboldt）大学的Finke等对10例分别罹患肾癌、结直肠癌、淋巴瘤的晚期肿瘤患者应用IL-2 基因转染的CIK 细胞，其中3例呈现静息状态，1例淋巴瘤患者获得缓解。另有研究者报道了应用CIK 细胞治疗63例肿瘤患者的近期疗效，其中肝癌15例，胃癌14例，食管癌11例，肺癌6例，乳腺癌5例，其他肿瘤12例；肿瘤分期为Ⅱ～Ⅳ期，结果显示CIK 细胞对实体瘤疗效显著，无毒副作用。CIK 细胞对表达Pgp的肿瘤细胞具有有效的杀伤作用，甚至对阿霉素耐药的K562细胞系比其亲代细胞对CIK 细胞更敏感，CIK 细胞的这一特性使其在耐药肿瘤的治疗上具有明显的优势。前面提到的TG 活化的CIK 细胞在随后开展的临床试验中治疗了5位放化疗失败的成年肿瘤患者，使这几名患者的生存质量改善，平均生存期相应得到了提高[39]。

意大利学者Sangiolo[40]将2011年以前多家单位的临床试验治疗数据[41-48]（包括肠癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、胃癌等）进行搜集、汇总，同时将患者疾病进展状态、CIK 细胞来源、副作用、临床疗效加以比较、分析，对这一疗法的临床作用和有效性给予了充分认可和肯定。

目前国际上对生物治疗的作用和疗效已得到相当认可，各地区、各国家之间的协作和交流日益增加，CIK 治疗国际网站（International Registry on CIK Cells，IRCC）定期发布的信息将使我们可以随时、随地了解世界各国 CIK 细胞治疗的动态及进展。

6.3 疗效评估

近年来，应用CIK 细胞进行实体瘤治疗的临床试验在国内外陆续开展，CIK 可作为单独的治疗方法，也可和外科手术，放疗，化疗进行综合治疗，还可作为个体化治疗和其他疗法（如中医中药）结合起来。经验提示在治疗时选择肿瘤负荷相对较小的患者，可以起到减轻症状（包括血液、生化指标、肿瘤标志物等），增加体力，提高免疫能力（CD3、CD4、CD8、CD56等免疫细胞比值和数量的增加），减少肿瘤负荷。回输相对较多的CIK 细胞，或增加回输数量和次数，即提高效靶比例可以使疗效适当提高。中晚期患者减轻临床症状，提高生存质量，延长生存期或长期带瘤生存同样是我们关注的目标。

6.4 心理护理

较之手术，放化疗所谓的经典治疗和上世纪末LAK、TIL 过继免疫疗法，CIK是一种新的肿瘤生物治疗方法，因为开展的单位相对不多，好多患者包括某些医院或科室的医生对此疗法也知之甚少，有人只是偶尔接触或道听途说，知其然不知所以然，甚或抵触、非难者也兼而有之。因此接诊时要耐心细致地向患者及家属介绍CIK的概念、方法、疗效、可能出现的副作用等。回输时最好安排医护人员在现场，一旦出现问题，可对症处理，及时解决[49]，消除其疑虑及恐惧心理。

6.5 副作用及对策

CIK 细胞临床应用时的副作用主要包括：轻度发热、畏寒、疲乏等，个别人偶见关节痛、腹痛等。一般表现为类感冒症状，这些症状主要和IL-2的副作用相关联，均较轻微而且可以自行缓解。一般发热都在38℃以下，可不用处置，但如患者在输注过程中体温超过39℃，应立即停止治疗，寻找原因并及时处理，通常给予解热镇痛剂对症治疗。根据国内外不同实验室的报道发热的患者占总体治疗人数的3%～30%，在治疗中遇见的发热患者比例尚不足1%，应该说严格的操作管理，合理的治疗流程以及到位的质控措施是不可或缺的。

7 回顾与展望

近年来CIK 细胞在基础和临床研究两方面都取得了长足的进步，成为新一代肿瘤过继免疫治疗的主力军，是目前及将来生物学领域研究热点之一。目前，在美欧、亚洲、大洋洲的十几个国家都已经进入临床试验治疗。纵观国内，特别是近几年来已有数百家医院及科研院所相继申请或开展，发展势头较好，这首先得益于卫生部将体细胞治疗列为第三类临床技术的国家政策，其次中国人口众多，肿瘤的发病例也持续居高不下。但在CIK 临床治疗逐渐市场化的发展过程中也不可避免地存在许多问题有待解决，今后应在以下方面引起注意并需进一步付诸努力：①扩大宣传力度，增加社会公众对CIK 治疗的认知和了解，这不仅是从事此工作医护人员份内的事也是医疗行政和监管部门的责任和义务。②加强申报、审批、指导及监管制度，在积极推进第三类临床技术准入的同时，坚持条件，严格把关。切实管理好医疗市场。同时降低各级医疗单位的收费标准或提高报销比例，在此基础上扩大治疗样本更多的让事实说话，让更多的肿瘤患者受益。③精心设计，精心管理，精心治疗，设立严格的对照，尽量不出纰漏和医疗差错，拿出令人信服的证据和经得起推敲的科学结论。④建立CIK 细胞过继免疫治疗的统一方案和标准的治疗流程，寻找细胞因子联合应用的最好组合，制订个体化治疗方案，提高针对性及有效性。⑤CIK 细胞治疗在严格质量控制，合理应用剂量、回输途径及临床护理等方面亦需要更加深入的探索和研究，适时建立培训、检查、监督体系，对于保证不了治疗质量的单位限期整改或予以注销治疗资格，防止因经济利益化驱使而将治疗引入歧途。⑥提升治疗水平，增加科技含量。意大利和法国学者Virna、Heleue等人将编码抗CD33-C 和抗CD33-CCD28-OX40-C 受体基因的SFC 逆转录病毒载体导入CIK 细胞，结果显示转基因细胞极大地改善了抗白血病活性，提示此种细胞可提供最佳的杀伤活性，对不同来源的急性髓性白血病细胞的杀伤活性提高到了80%，并成功释放高水平的细胞活性因子[50]。Sheen 治疗组尝试将患者的T 细胞导入抗CEA受体抗体，成功地诱发T 细胞活化以对抗自体肿瘤细胞[51]，与此相关联的研究将CD28 和CD3ζ信号区域（signalling domains）基因重组的BW431/26-scFv-Fc-CD28-ζ受体导入T 细胞，或将肿瘤抗原、T 细胞受体、配体或单克隆抗体等通过基因工程的方式转导给CIK 细胞，以加强其趋化性，提高特异性，解除对肿瘤细胞的免疫耐受[42，52-56]，这些新治疗元素的引进以及新方法、新措施的创建无疑将给肿瘤生物治疗带来新的勃勃生机。

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