中药专业研究生培养系列之HPLC含量测定带教探讨

2013-01-31黄月纯

中国中医药现代远程教育 2013年21期

关键词：液相色谱仪果酸检测器

黄月纯

黄月纯

（广州中医药大学第一附属医院，广州510405）

中药专业研究生培养是医院药学部教学计划中的组成部分，是培养研究生技能的重要桥梁之一，本文对中药学研究生培养中最基本、最常用的中药分析技术HPLC含量测定的带教培养进行探讨。

中药专业；硕士研究生培养；高效液相色谱法；带教

中药学专业研究生的培养是大型综合性医院药学部（药剂科）教学计划中的组成部分，是培养研究生技能的重要桥梁之一。高效液相色谱法（HPLC）含量测定是药物分析最常用的技术，不仅是中药质量研究方向研究生应掌握的技术，也是制剂工艺研究方向研究生应掌握的技术，此外有些从事药理方向研究生也会涉及到HPLC技术。HPLC含量测定是研究生阶段从事质量分析研究的基础，是质量标准研究的前提。在大学本科阶段，真正掌握了HPLC含量测定方法相关仪器操作、实验过程操作、方法调整、数据分析处理等技术的学生不多，因此，有必要把HPLC含量测定作为研究生技能培养系列内容之一。本文对高效液相色谱仪原理、操作技能、含量测定标准方法解读及应注意的实验细节等方面的带教培养进行探讨，以培养研究生的操作技能以及提高分析和解决实际问题的能力。

1 介绍高效液相色谱仪原理培训仪器操作技能

目前国内常用的高效液相色谱仪的生产厂家主要有Agilent、Waters、岛津、戴安等。检测器有紫外检测器（含二极管阵列检测器）、荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器、质谱检测器等。紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供试品溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。不同检测器原理有较大差异，不同厂家仪器的操作系统亦有不同，而且在本科阶段，大多学生只是了解了高效液相色谱仪的基本原理，少有机会进行实际操作。因此，研究生在使用高效液相色谱仪前，应先进行高效液相色谱仪的原理介绍，针对实验室现有的仪器型号进行操作规程的介绍、操作技能培训以及必要的维护等。

2 选择示范的含量测定标准方法了解学生对标准方法的掌握程度

2.1 示范的含量测定标准如枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量测定［1］。

含量测定参照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21）为流动相；检测波长为210nm。理论板数按熊果酸峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含齐墩果酸50μg，熊果酸0.2mg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粗粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50ml，称定重量，超声

处理（功率250W，频率50k Hz）30分钟，放冷，再称定重量，加乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含齐墩果酸（C30H48O3）和熊果酸（C30H48O3）的总量不得少于0.70%。

2.2 了解研究生对方法的掌握程度针对标准方法，可先让研究生拟定详细的实验步骤，以便了解学生对标准方法的了解及掌握程度。

3 详细分析含量测定标准项目内容及应注意的实验细节

虽然标准只规定了几行，但包含了较多的信息及要求，需要研究生对标准项目进行深入了解，才能避免实验出现差错。

3.1 色谱条件与系统适用性试验

3.1.1 适宜型号色谱柱的选择高效液相色谱法多采用反相高效液相色谱，标准中一般采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（即C18柱），C18柱的厂家、型号、规格很多，一般标准未规定C18柱型号、规格，可采用进口或国产C18柱。不同C18柱对色谱峰的保留时间往往有较大差异，可通过调节流动相比例以达到合适的分离效果。但有些样品特别是同时测定多种含量的样品的分离度对色谱柱要求相对较严，当分离度达不到要求时，可参考文献报道方法，选择合适的色谱柱型号、规格。如红参［1］中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量测定，采用Zorbax SB C18柱（250×4.6mm，5μm），人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度相对较好。如地黄［1］中梓醇的含量测定，以乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶99）为流动相，有机相乙腈所占比例很小，采用一般C18柱进行分析，保留时间太短，如采用全水相柱［如Zorbax SB Aq柱（250×4.6mm，5μm）］则可延长保留时间。在研究生带教时，应对学生介绍十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的含义，也应简单介绍C18柱型号、规格的必要性，同时也要让学生查询有关研究的参考文献，选择适宜的色谱柱。

3.1.2 检测波长的固定及参数的优化检测波长是HPLC测定最重要的参数，紫外、荧光、电化学检测器均规定了检测波长。标准规定的检测波长固定，不允许更改，但在仪器的一些参数（带宽、参比波长、峰宽、狭缝）选择方面则是应进行优化选择。以Agilent公司仪器为例，使用较宽的带宽有降低噪声的优点，如使用30nm带宽比4nm带宽基线噪声降低约2.5倍，而信号值是4nm带宽的75%，一般情况选择4、8nm带宽即可；参比波长一般可不选择，但有些成分分析的基线漂移严重（如氨基酸），则使用参比波长对基线有明显改善；峰宽（响应值）应尽可能接近要测的窄峰峰宽，可选“2s”或“4s”；窄狭缝（如4nm）光谱分辨率高，一般检测可选用，宽狭缝（如8、16nm）噪音低，当采用末端检测波长（如203nm）可选用，如枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量测定，流动相为乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21），检测波长为210nm，狭缝选择16nm，基线噪音较小［1］。对于带宽、参比波长、峰宽、狭缝等要求在标准未注明，需要提醒学生注意。

3.1.3 流动相系统组成的固定及比例的调整流动相系统是实验中容易发生误区的地方，大多学生以为流动相系统比例是固定、不可改变的，拿到标准或参考方法一成不变进行试验，结果往往不理想，如目标色谱峰的保留时间太短、分离度下降或保留时间太长、峰变宽，理论板数不符合要求等。因此，在带教中应向学生明确标准规定的流动相系统（如甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸）是固定的，但色谱峰保留时间及分离度易受不同色谱柱、流速、柱温、室温、流动相厂家等因素影响，应根据初试结果，进行流动相比例的调整。流动相一般为有机相与水相组成，可采用泵的两个通路；有些为三种组成，如枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸含量测定的乙腈-甲醇-0.5%醋酸铵溶液（67∶12∶21），可采用泵的三个通路。对于非梯度系统的系统，也可将有机相与水相混合后在一个通路中进行试验。

3.1.4 流速、柱温的选择一般标准未规定流速、柱温，可采用常规流速1ml／min，柱温可为室温10～30℃，有柱温箱条件的仪器可设定温度，如25℃、30℃等。

3.1.5 系统适用性试验的要求《中国药典》2010年版附录ⅥD“高效液相色谱法”项下明确了适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。在标准中各品种项下一般只规定了理论板数，其他参数参考附录执行，这部分要求往往是学生容易忽视的地方。因此，在HPLC含量测定技能培训中，应指导学生学习附录相关要求。对于不同待测成分、不同品种项下某些相同待测成分的理论板数规定有差异，应选择适宜型号的色谱柱及调整流动相比例使理论板数符合标准要求。待测峰与相邻峰的分离度应大于1.5。在系统适用性试验中的重复性用于评价连续进样色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时通常取对照品溶液连续进样5次，测定峰面积的相对标准偏差应不大于2.0%。拖尾因子用于评价色谱峰的对称性，在峰高法定量时作要求，而峰面积法测定时，除拖尾严重外作出特殊规定外，一般不作要求。

3.2 对照品溶液的制备对照品浓度配制准确与否直接影响到含量测定结果，因此在操作前应对学生进行明确说明可能出现及应注意的问题。一般在保存条件良好的对照品按要求配制即可；有些对照品需干燥后取样（如黄芩项下的黄芩苷对照品应60℃减压干燥4小时后称量［1］），应按要求干燥；有些成分（如金银花项下的绿原酸［1］）遇光容易分解，需配制在棕色瓶中。由于对照品溶液浓度较小（有些仅为10μg／ml），因此应向学生明确使用的电子天平精度应为十万分之一。对于配制的浓度应尽可能与标准中规定的浓度相一致，具体应根据称量时的具体重量而定。有些对照品溶解性差（如大黄含量测定项下的大黄素等五种游离蒽醌［1］），必要时应加热处理或超声处理使溶解。由于对照品较昂贵，配制的对照

品浓度应注明浓度、配制日期，使用后密闭置冰箱中保存备用。

3.3 供试品溶液的制备药材或饮片应按要求粉碎成一定的粉碎度，如粗粉、粉末（过四号筛）等。取样应精密称定，宜使用精度为万分之一的电子天平，至少取样两份。考虑学生操作技能的熟练程度及可能造成的误差，取样量三份较适宜。研究生通过本科教育一般基本掌握了样品的制备方法，容易出现误差的地方大多对定量操作把握程度不够，因此，主要针对不足进行称重、量取、定容等细节进行技能培训。另外应对规定“按干燥品计算”进行补充，除另有规定外，应取未干燥的供试品进行试验，并将计算中的取样量按［检查］项下测得的水分扣除。

3.4 测定法标准中要求分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各一定量，注入液相色谱仪，测定对照品溶液及供试品溶液中待测成分的峰面积，按一定的公式计算含量。HPLC法测定含量常采用外标法计算含量。对于进样量问题，研究生也常有误区，认为不可改变，实际上有时应根据需要进行调整。如某些型号色谱柱对某些色谱峰分离度不佳，特别是以甲醇-水为流动相系统，供试品溶液以甲醇为溶媒的条件下，常出现前沿峰，理论板数下降，如青皮项下橙皮苷含量测定规定进样量为10μl［1］，改为5μl峰形明显变得尖锐；有时某些色谱峰（如绿原酸）在进样量较大（10μl）时出现双峰，改为5μl则为仅为单峰而且峰形明显变得尖锐。