变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究

宋宏新， 刘 静， 张 歌， 李红心

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

乳与乳制品含有丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质及多种维生素[1]，是一类营养丰富的理想食品，牛乳和羊乳是两类重要的乳品工业原料.羊乳的营养物质易于吸收、风味独特[2]，但羊乳资源相对匮缺，致使其市场价高量少，在利益驱动下不法商贩将牛乳掺入羊乳中降低成本，这种掺假不仅存在于羊乳及其制品中，更多地会出现在原料乳的收购过程.国际贸易对羊乳制品纯度要求高(大于95%)，羊乳制品企业在生产经营过程对原料及产品的保真性检验是一个急待解决的问题，基于牛羊乳成分的差异比较研究是解决羊乳中掺入牛乳成分的技术关键.

羊乳与牛乳的外观和主要化学成分相似，其差别主要是在脂肪酸、蛋白质种类等微观组成上.乳蛋白质是乳制品的重要营养质量指标之一，乳蛋白质主要包括酪蛋白和乳清蛋白两大类[3]，乳脂肪球膜蛋白的含量相对较少.蛋白质的电荷和分子质量特性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是蛋白质分离分析的良好方法，PAGE分为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)，两种电泳系统的主要差别是SDS-PAGE添加SDS和疏基乙醇变性剂，并在加热条件下将聚合蛋白质充分变性为亚基进行分离，而native-PAGE不含变性剂，多在低温条件下对天然构象的蛋白质(寡聚或单体)进行分离.SDS-PAGE是乳品蛋白质研究应用最广泛的方法[4]，native-PAGE的研究报道较少，本实验通过对牛羊乳在变性及非变性条件下的电泳分析，建立分析牛羊乳蛋白质的方法，通过比较牛羊乳的蛋白质差异为羊乳中掺入牛乳成分的分析检验提供依据.

1 材料与方法

1.1 实验仪器

分析天平(万分之一克)，北京赛多利斯仪器系统公司；T-1000型电子天平，江苏常熟双杰测试仪器厂；HC-3018R高速冷冻离心机；WH-3微型旋涡混合仪，上海泸西分析仪器厂；移液枪，德国艾尔德股份有限公司；101-2A型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；PB-10型酸度计，北京赛多利斯仪器系统公司；恒温水浴锅，国华电器有限公司；TS-2型脱色摇床、恒温器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HoeferminiVE型电泳槽，美国GE公司；BG-Power600型电泳仪，北京百晶生物技术有限公司；JD-801型捷达图像分析系统，江苏省捷达软件工程有限公司.

1.2 实验药品及材料

主要试剂：丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺，优级纯，美国Amersco公司；十二烷基硫酸钠(SDS)，优级纯，美国USB公司；过硫酸铵，分析纯，北京化学试剂厂；四甲基乙二胺(TEMED)，优级纯，北京化学试剂厂；α-乳白蛋白、β-乳球蛋白：美国Sigma公司；分子量标准蛋白Maker，科昊生物工程有限责任公司；硫酸铜、硫酸钾、Tris-Base、巯基乙醇、考马斯亮兰R-250、甘油、溴酚蓝、盐酸、甲醇、冰乙酸等其它常用试剂为分析纯级.

1.3 样品及处理

牛乳：西安未央区韩家湾奶牛场当天产的鲜乳.奶牛健康状况良好，无乳房炎、消化道疾病等.羊乳：西安市北郊夏家堡某农户家关中奶山羊当天产的鲜乳.

脱脂牛、羊乳：取新鲜牛、羊乳在4 ℃ 5 000 r/min下离心30 min，弃去上层脂肪即得.

牛、羊乳酪蛋白：酪蛋白的制备方法采用的是等电点沉淀法[5]，脱脂乳加热37 ℃，用0.1 mol/L HCl调pH(牛乳调至pH4.6，羊乳调至pH4.1)，40 ℃保温30 min沉淀酪蛋白，5 000 r/min离心10 min，下层沉淀干燥即为酪蛋白.保留上清液用于清蛋白制备.

牛、羊乳清蛋白：上步保留的离心上清过滤除去残留酪蛋白颗粒即为清蛋白液.

羊乳中掺入不同比例牛乳样品的制备：分别取脱脂乳按脱脂羊乳和脱脂牛乳体积比(V∶V)95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50分别混匀，即制得掺入5%、10%、20%、30%、40%、50%脱脂牛乳的脱脂羊乳样品.

α-乳白蛋白：准确称量0.01 gα-乳白蛋白标准品溶于1 mL纯净水中.

β-乳球蛋白：准确称量0.01 gβ-乳球蛋白标准品溶于1 mL纯净水中.

1.4 电泳方法

1.4.1 SDS-PAGE

(1)样品处理：2×变性样品缓冲液(pH8.0：0.125 mol/L Tris-HCl，2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝，5%巯基乙醇，调完pH后再加巯基乙醇).脱脂乳用蒸馏水稀释5倍，取一定量与等体积2×变性样品缓冲液混合.乳酪蛋白样品用0.05 mol/L 氢氧化钠溶液溶解成乳酪蛋白浓度6 mg/mL，取一定量与等体积的2×变性样品缓冲液混合.乳清蛋白样品直接与等体积的2×变性样品缓冲液混合.α-乳白蛋白和-β-乳球蛋白标准液与等体积的2×变性样品缓冲液混合.掺入不同比例脱脂牛乳的脱脂羊乳样品与等体积的2×变性样品缓冲液混合.所有样品电泳前用混合仪混匀，煮沸5～10 min，10μL进样.

(2)电泳及分析[6]：分离胶质量浓度为12.5%，浓缩胶质量浓度为3%[7]，凝胶厚度为1 mm的垂直不连续SDS-PAGE，缓冲系统中含0.1% SDS，预电泳电流为15 mA，样品进入分离胶后调到30 mA.电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，甲醇、冰醋酸溶液脱色，用捷达图像分析系统对电泳图片进行扫描.以SDS-PAGE分子量标准制作蛋白质(亚基)分子量对数与电泳迁移率的标准曲线，该曲线方程为logMW=-1.379x+2.134(MW—蛋白质分子量；x—电泳迁移率)，R2=0.969，计算各蛋白组分的分子量大小.

1.4.2 native-PAGE

(1)样品处理：2×非变性样品缓冲液不含 SDS和巯基乙醇(1.25 mL pH6.8，0.5 mol/L Tris-HCl，3.0 mL甘油，0.2 mL 0.5%溴酚蓝，5.5 mL水.)乳酪蛋白固体样品的溶解，其它乳品样的稀释，液体样品与2×非样品缓冲液等体积混合与SDS-PAGE样品处理相同，不同的是样品仅需用混匀仪充分混合不加热，10μL进样.

(2)电泳及分析[8]：分离胶质量浓度为8%，浓缩胶质量浓度为5%[9]，凝胶厚度为1 mm的垂直不连续native-PAGE，缓冲系统不含SDS，预电泳电流为15 mA，样品进入分离胶后调到20 mA.为防止蛋白质在电泳过程中变性，电泳在0～4 ℃进行.电泳结束后染色脱色等程序同SDS-PAGE.

2 实验结果与分析

2.1 SDS-PAGE

对脱脂牛羊乳及其清蛋白酪蛋白样品进行SDS-PAGE电泳结果见图1(左).

M.分子量标准蛋白质；1.脱脂羊乳；2.脱脂牛乳；3.羊乳酪蛋白；4.牛乳酪蛋白；5.羊乳清蛋白；6.牛乳清蛋白；7.α-乳白蛋白；8.β-乳球蛋白图1 脱脂牛羊乳及清蛋白酪蛋白的SDS-PAGE E(左)和native-PAGE(右)图谱

SDS-PAGE电泳可以将蛋白质变性为亚基，按其分子量大小进行分离，图1(左)显示从电泳的负极(上)到正极(下)可以显示乳中蛋白质(亚基)含量较大的组分有8种，依据分子量标准及两种牛乳α-乳白蛋白和-β-乳球蛋白标注蛋白质，将其分为上(高分子量)、中(中分子量)和下(低分子量)3组，对其分子量和蛋白质种类进行以下讨论：

上端的高分子量区域主要为血清白蛋白(72.1 KD)和免疫球蛋白(IgG)，SDS-PAGE看到的IgG只是由于巯基乙醇和SDS变性裂解的IgG的重链[10]，羊乳IgG重链的分子量(56.9 KD)较牛乳(57.8 KD)小.下端的小分子量组主要为β-乳球蛋白(12.0 KD)及α-乳白蛋白(10.4 KD)，仅从分子量看，在此区间牛羊乳的差别不大.由图可见羊乳(泳道5)和牛乳(泳道6)清蛋白主要分布在高分子量和低分子量区.

中间的中分子量区主要为羊乳和牛乳酪蛋白(泳道3和泳道4)：αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN 4种，牛羊乳的差别明显，羊乳αs2-CN分子量(35.9 KD)大于牛乳αs2-CN分子量(34.2 KD)，牛乳α-CN含量比较多，羊乳β-CN含量(条带更深)比较多.

可见SDS-PAGE对两种乳品蛋白质的分离较好，电泳条带多而清晰，并且有较好的重复性，两种乳品酪蛋白的区分最好.

2.2 native-PAGE

对脱脂牛羊乳及其清蛋白酪蛋白样品进行native-PAGE电泳结果见图1(右).

native-PAGE分离羊乳及牛乳蛋白质的电泳图谱条带明显比SDS-PAGE条带少，中间区域的酪蛋白仅有两条，且条带拖尾不清晰，虽然也能显示两种乳品(泳道3和泳道4，泳道1和泳道2)的差别，但是信息量较少，推测是由于多种酪蛋白以胶束状态在native-PAGE时泳动的特点.

在下端的低分子区域可以看出乳清蛋白分离效果良好.羊乳与牛乳清蛋白的差别明显：羊乳清蛋白(泳道5)仅为一条带，表明羊乳非变性条件下羊乳的乳白蛋白和乳球蛋白聚合成一个较大的羊乳清蛋白(寡聚蛋白)而存在；牛乳清蛋白(泳道6)可分为三条，一条为牛α-乳白蛋白(泳道7)，最下端的两条为牛β-乳球蛋白(泳道8)，显示牛β-乳球蛋白有两种不同聚合形式存在.

比较两种牛标准清蛋白的native-PAGE和SDS-PAGE图谱发现：图1(左)中牛α-乳白蛋白亚基是分子量最小的一条带(图1左泳道7)，图1(右)则显示牛α-乳白蛋白(图1右泳道7)分子量较牛β-乳球蛋白大；图1(左)显示牛α-乳白蛋白亚基仅一条带，图1(右)则为两条，此现象的合理解释是两种乳清蛋白的天然(非变性)状态都是由相同亚基(图1左为一条带)的多个亚基聚合而成的寡聚蛋白.

native-PAGE分离乳蛋白质的条带虽然较少，但是对清蛋白的分离效果良好，明显的差别是最下端的牛乳较羊乳体多两条β-乳球蛋白条带，可以作为区别牛羊乳的良好标志.

2.3 两种电泳方法检测羊乳中掺入牛乳结果及分析

羊乳中掺入不同比例牛乳样品的两种电泳分析结果见图2.

1.脱脂牛乳;2.脱脂羊乳;3-8.分别为掺入5%、10%、20%、30%、40%、50%脱脂牛乳的脱脂羊乳图2 羊乳中掺入牛乳的SDS-PAGE(左)和native-PAGE(右)图谱

比较SDS-PAGE(图2左)和native-PAGE(图2右)图谱可以看出，前者分离乳蛋白质的条带多而清晰，能够比较全面的表征乳蛋白质的组成.SDS-PAGE图谱显示牛乳IgG-H分子量比羊乳大，含量较羊乳少，最明显的差别是酪蛋白αs2-CN的分子量和αs1-CN含量，牛乳αs1-CN含量较羊乳多(条带颜色较深)，当向羊乳中掺入5%含量的牛乳时(图2左，泳道3)就可以看出条带的差异.

图2(右图，泳道1和泳道2)显示native-PAGE对酪蛋白及高分子量清蛋白分离不好，但是最前端小分子乳清蛋白差别明显，牛乳较羊乳多出两条β-乳球蛋白条带，羊乳随着掺入脱脂牛乳比例的变化，β-乳球蛋白条带(泳道2-8)从无到有并逐渐加深，两条β-乳球蛋白条带可以作为羊乳中掺入牛乳的特征蛋白，实验显示的检测阈值为5%.

比较羊乳和牛乳蛋白质差异，SDS-PAGE显示的αs2-CN和αs1-CN在较多的蛋白质条带中较难区分，而native-PAGE显示的两条β-乳球蛋白条带从无到有更易观察识别，以其差别为基础建立的羊乳中掺入牛乳成分更可取.

3 结论

对牛乳和羊乳及由其制得的酪蛋白清蛋白进行两种电泳方法分析比较发现以下特点：SDS-PAGE法由于变性可以将聚合蛋白变性成单体蛋白质或亚基，该条件下的电泳分离效果好，可以显示更多的电泳条带(8～10条)，在该条件下牛羊乳最主要的差别是酪蛋白，羊乳αs2-CN分子量(35.9 KD)大于牛乳αs2-CN分子量(34.2 KD)，羊乳αs2-CN含量较高，而牛乳αs1-CN含量较高(条带更深)；native-PAGE法乳品中蛋白质是以天然(非变性)的完整聚合蛋白质进行分离，酪蛋白变条带少(几种酪蛋白聚合成酪蛋白胶束)且分离效果较差；小分子量的乳清蛋白分离好，羊乳有一条较大的羊乳清蛋白(羊乳的乳白蛋白和乳球蛋白聚合成一个蛋白质)，而牛乳清蛋白分有一条牛α-乳白蛋白，最下端有两条牛β-乳球蛋白，这也是native-PAGE显示羊乳和牛乳蛋白质最明显的差别，可以作为羊乳中掺入牛乳的检测特征目标蛋白.比较而言，native-PAGE更能明显区分牛羊乳，当羊乳中掺入5%牛乳时，在native-PAGE电泳图谱中就可以看出明显差异.

从电泳操作方法比较，SDS-PAGE比较成熟，结构较稳定，反映的酪蛋白种类信息更多，native-PAGE试剂少不变性，要求在较低温度下进行，蛋白质的溶解性对分析影响较大，更适应于乳清蛋白分析，可以作为羊乳中掺入牛乳的有效检测方法之一.进一步比较两种电泳清蛋白电泳结果，天然状态的羊乳清蛋白与牛乳清蛋白的差别显著，然而，有关羊乳清蛋白质中的乳白蛋白和乳球蛋白是如何聚集和其蛋白质结构特点的细节，还有待更深入的蛋白质结构解析研究，羊乳清蛋白质与牛乳清蛋白质的不同，究竟是如何影响羊乳的加工和营养消化特性也有待研究.native-PAGE可以作为羊乳中掺入牛乳成分的有效检测方法.

[1] 唐 萍,田 晶,佘振宝.奶制品中蛋白质测定的毛细管电泳法研究[J].分析科学学报,2006,22(1):5-8.

[2] 程潄兰，姚 莉，崔惠玲，等.WTO背景下的中国奶业发展前景[J].农业经济问题,2002,23(3):12-14.

[3] 宋宏新，刘立新，柏红梅,等.牛乳中蛋白质的电泳分析技术研究[J].食品与机械，2010，26(6)：51-53.

[4] 陈丹华.蛋白质凝胶电泳及其分析应用[J].分析科学学报，1995，11(3)：75-86.

[5] 汪家政，范 明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2000：67．

[6] 韩奕奕，黄菲菲，王建军,等.凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定乳与乳制品中β-乳球蛋白的含量[J].乳业科学与技术，2009，32(2)：74-77.

[7] 宋宏新，李敏康.现代生物化学实验技术教程[M].陕西：陕西人民出版社，2000：160-162．

[8] Hames B.D.,D.Rickwood eds.Gel electrophoresis of proteins:A practical approach[M].London:IRL Press.,1981.

[9] 希尔德布兰特F，伊格莱西P.分子医学技术[M].林建银，译.北京：北京科学出版社，2001：54-56.

[10] Kinghorn N M,Norris C S,Paterson G R.Comparison of capillary electrophoresis with traditional methods to analyse bovine whey proteins[J].J Chromatogr A,1995,700:111-123.