青蒿素的研究思路与启示

杜婕莹

青蒿素的研究思路与启示

杜婕莹

青蒿素是我国科研工作者首次从青蒿中分离鉴定得出的具有高效低毒的抗疟特效药，其产生发展及在治疗疟疾方面的出色表现对我国中药事业具有深远的影响，本文对青蒿素的研究思路进行了综述，研究探讨了青蒿素未来发展方向及新药开发的启示。

青蒿素；衍生物；药理作用；生物合成；启示

青蒿，又名黄花蒿（Artemisia Annu.L），是主要分布于我国广西、云南、四川等地的菊科一年生草本植物。从黄花蒿中提取分离得到的有效成分——青蒿素（Artemisinin），是我国科研工作者首次从青蒿中分离鉴定得出的具有高效低毒的抗疟特效药[1]。在青蒿素的基础上，又可合成多种衍生物，包括蒿甲醚（Artemether）、蒿乙醚（Artemotil）、青蒿琥酯（Artesunate）、双氢青蒿素（Dihydroartemisinin, DHA）等。

疟疾（Malaria）是一种在热带、亚热带地区由疟原虫（Plasmodium falciparum）所引发而广泛传播的寄生虫病。据世界卫生组织（WHO）报告，疟疾每年会导致3至5亿人感染、一百多万人死亡，其中大多数为孕妇和5岁以下的儿童[2]。因青蒿素本身的结构和代谢特点，在治疗疟疾方面有速效、高效、复燃率低和不易产生抗药性等特征，受到WHO的青睐[3]。中国研发的蒿甲醚、青蒿琥酯和复方蒿甲醚已先后于1997、2002和2003年被WHO列入第9、11和12版基本药物目录（Essential Medicine List）。中药是我国传统医学的瑰宝，青蒿素是唯一被WHO认可的中药，也是仅有的两个被收入世界药典的中药之一，其产生发展及在治疗疟疾方面的出色表现对我国中药事业具有深远的影响，本文对青蒿素的研究思路进行了综述。

1 青蒿素的发现

国家科委和解放军总后勤部于1967年5月23日召开“疟疾防治药物研究工作协作会议”，由此确立了由全国多部门参加的、以疟疾防治药物研究为任务，代号“523”的紧急军工项目[4]。

青蒿素结构研究协作组从菊科植物黄花蒿中，分离出一种无色针状结晶，定名为青蒿素，熔点156至157℃，其分子式为C15H22O5。根据光谱数据和X-射线分析及化学反应，证明其为一种新型的倍半萜内酯[5]。随后，通过一系列化学反应、质谱、核磁共振谱和红外光谱对其结构进行进一步的研究，证明青蒿素的确是含有一个过氧基团的化合物[6]。青蒿素具有两个明显的特征，一是含有双烷基的过氧基团，并成为缩酮的一部分，而且它含过氧基团却又相当稳定；另一特征是此过氧基团开始存在着氧-碳-氧-碳交替的链节，使分子的一侧具备了连环套似的奇特结构[7]。青蒿素结构的特殊性，使得若按以前的经典方法难以判定其分子中的碳和氧原子究竟以何种方式相连成骨架，因而采用X-射线单晶衍射法，确定了构造和相对构型。最后于1978年由反常散射X-射线衍射法确定了青蒿素的绝对构型[8]。

2 青蒿素衍生物的合成

随着青蒿素的发现及最初几年来的临床使用得出，其具有近期复发的缺点以及制剂上的一些问题。中国科学院上海药物研究所抗疟研究组对青蒿素进行了一系列的结构改造工作[9]。青蒿素是具有双烷基过氧基团的倍半萜内酯，经氢化生成氢化青蒿素；与钠硼氢反应可将内酯环上的羰基还原成羟基，得到还原青蒿素。通过抗疟药理研究，发现前者无抗疟活性，后者的抗疟活性则比青蒿素增强一倍。通过对构效关系的研究发现，过氧基团是青蒿素中抗疟的主要有效基团，并从还原青蒿素出发合成了一系列的青蒿素衍生物。其中蒿甲醚、青蒿琥酯的合成解决了传统抗疟药物抗药性和青蒿素临床应用的剂型问题，抗疟活性也得到了提高。

随着青蒿素及其衍生物在临床上的广泛应用，近十多年来，国内外学者开始了其对其它疾病治疗作用的研究。研究发现，青蒿素及其衍生物具有更广泛的药理作用，如抗其它寄生虫病[10-11]、抗癌[12-20]、免疫调节作用[21-24]和治疗皮肤病；其中抗癌及免疫调节作用日益受到重视，研究也越来越深入。

3 青蒿素的合成

青蒿在世界各地均有分布，但青蒿素的含量却与产地密切相关。在我国，北方产的青蒿中青蒿素的含量极低，其从南到北呈递减趋势。由于青蒿中青蒿素含量偏低，而随着国际市场的开拓，野生资源已不能满足世界范围内对青蒿素原料的需求，植物性原材料紧张造成青蒿素短缺，同时提取环节复杂，费时费力，致使青蒿素的生产成本高，产量低，难以满足市场需要[25]。

3.1 化学合成Schmil等[26]于1983年报道了应用关键化合物5（肛H），在低温条件下通过光氧化反应引入过氧基团的全合成路线。Xu等[27]于1986年报道了青蒿素的全合成途径。但由于青蒿素有多个手性碳原子，使得合成步骤非常复杂、产率低、成本高，从而很难应用于工业化生产[28]。

3.2 生物合成

3.2.1 组织培养可通过诱导出愈伤组织，然后由愈伤组织诱导出丛生芽，或者利用发根农杆菌感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后诱导出青蒿素含量较高的黄花蒿发根，这种方法是通过将Ri质粒上的T-DNA片段整合进植物细胞核基因组中诱导产生多分枝的不定根，通过质粒转化的毛状根生长迅速，遗传特征和生理生化特性稳定，次级代谢产物合成能力强，有可能用于大规模工业化生产[29]。

3.2.2 转基因克隆通过用携带外源基因的农杆菌感染健壮的黄花蒿植株，将外源基因插入到目标DNA的特定部位，然后对获得的外源基因植株进行继代培养，以得到性状稳定的高产黄花蒿品系。或者采用组合生物合成法将不同生物体来原的基因组合在微生物体内生产出生物活性物质。Ro等[30]通过代谢工程获得了153mg/L的紫穗槐-4,11-二烯和115mg/L的青蒿酸。

3.3 生物合成途径青蒿素等倍半萜类的生物合成途经属于植物类异戊二烯代谢途经中的甲羟戊酸途经（Mevalonic acid,MVA），该途径在细胞质中进行。

3.3.1 青蒿素生物合成途经的关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶（HMGR）催化羟甲戊二酰辅酶A（HMG-CoA）形成MVA，由于MVA的形成是一个不可逆的过程，因此HMGR被认为是动物、植物、真菌和昆虫类异戊二烯代谢途经的一个限速酶[31]。HMGR萜类化合物合成中的重要调控点，尤其是倍半萜类物质的合成HMGR活性呈正相关。

法呢基焦磷酸合酶基因（FPPS）催化异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）通过缩合作用形成GPP，GPP再与IPP缩合形成倍半萜、三萜和多萜的共同前体FPP。要提高青蒿素的产量，提高FPP的量至关重要，主要有两种方式：方式一为导入与FPP合成相关的外源基因如HMGR、FPPS[32]；方式二为减少FPP流向萜类代谢的其它途经[33]。

紫穗槐-4,11-二烯合酶（ADS）为一种倍半萜合酶，FPP在ADS催化下发生自身环化生成青蒿素的第一个特异性前体物质紫穗槐-4,11-二烯[34]。紫穗槐-4,11-二烯含有一个烯丙基结构，很容易在紫穗槐-4,11-二烯P450单加氧酶作用下氧化生成相应的醇、醛和酸等化合物。

总的来说，青蒿素的合成首先由乙酰辅酶A经MVA途经生成FPP，然后FPP在ADS作用下环化生成紫穗槐-4,11-二烯，在P450的作用下紫穗槐-4,11-二烯氧化生成青蒿醇和青蒿醛，最后青蒿醛可能经过两条独立的氧化途经最后生成青蒿素。

3.3.2 从青蒿酸到青蒿素有观点认为，青蒿酸首先还原生成二氢青蒿酸，再经过多步复杂的反应生成青蒿素。但随着近年来的深入研究表明，青蒿素与二氢青蒿酸之间并没有发生相互转化[35]。紫穗槐-4,11-二烯P450单加氧酶编码基因CYP71AV1催化紫穗槐-4,11-二烯氧化生成青蒿醇，继而依次向青蒿醛和青蒿酸转化。青蒿酸氧化途经为植物中青蒿素的主要生物合成途径。

3.3.3 从二氢青蒿酸到青蒿素紫穗槐-4,11-二烯除了上述氧化途径外，还存在另一条氧化途径，即在CYP71AV1立体选择催化下，紫穗槐-4,11-二烯羟基氧化生成青蒿醇，随后向青蒿醛转化，青蒿醛在还原酶作用下生成二氢青蒿醛，二氢青蒿醛在脱氢酶作用下进一步氧化生成二氢青蒿酸[36]。在体外模拟植物体内存在的光化学反应条件下，二氢青蒿酸可转化成青蒿素，在反应的中间产物中检测到二氢青蒿酸氢过氧化物，认为从二氢青蒿酸向青蒿素转变的过程不需要酶的参与，在具光致敏性质化合物的激发下自发完成[37]。

4 启示

从青蒿素的发现、衍生物的合成到其药理作用、生物合成及作用机制的深入研究，青蒿素作为治疗疟疾的特效药，在国内及国际上发挥着举足轻重的作用，但要真正实现其工业化生产，以达到高产量、低成本的目的，仍有许多问题亟待解决。首先，虽然青蒿素的生物合成取得重大进展，但由青蒿酸向青蒿素的转化还未能在微生物体内完成，该转化所需相关蛋白酶的序列及相关基因的克隆与功能将成为日后的研究重点；其次，应优化植物基因在微生物体内的表达。由于外源基因或途径导入宿主细胞后，宿主细胞内部严格的基因调控系统被破坏，导致基因表达和酶活性失去平衡，如何开发新的高效宿主-载体系统、有效平衡外源生物合成途径值得深入探讨；再次，利用微生物合成青蒿素，建立高效的菌株发酵和产品纯化回收工艺同等重要；最后，青蒿素及其衍生物的抗肿瘤及免疫调节作用日益展现其光芒，应加强实验及临床研究，以开发新型抗肿瘤和免疫抑制药物。

青蒿素研究的思路与过程及其取得的成就为传统中药现代化开发提供了指导性的典范作用，提高了中药在世界上的地位。我国具有青蒿素类抗疟药的资源优势，但因科技创新的欠缺、市场份额的制约和急功近利的心态使这种优势转化成弱势。我国在对青蒿素类抗疟药研发的同时，应加强国际化运作方式，为青蒿素新一轮的博弈，甚至下一个“青蒿素”的研发与国际化做好准备，打好坚实的基础。从而使传统中药走向产业化、现代化、国际化，以充分发挥其经济效益和社会效益。

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Research Ideas and Revelation in Studies on Artemisinin

Du Jie ying

Artesunate is the high-efficiency and low-toxicity anti-malaria drugs that separated and identified from China’ s scientific researchers for the first time.Its emergence and development and the excellent performance in the treatment of malaria have a far-reaching influence for traditional Chinese medicine. This paper summarized the research ideas of artesunate and revelated its future development direction and new drug exploitation.

Artesunate; Derivative; Pharmacologic actions; Biosynthesis; Revelation

R2-03

B

1673-5846(2013)04-0058-04

广州市妇女儿童医疗中心中药科，广东广州 510623