HPLC法测定薏苡仁中甘油三油酸酯的含量

李 楠， 卢亚婷， 宋娟娜， 王 朴

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

薏苡仁是禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁.具有健脾、补肺、清热、利湿的功效, 《本草纲目》中称其乃上品养心药.其中薏苡仁油具有抑制肿瘤细胞生长，增强肌体免疫，保护因化疗引起的白血球减少的功效，其营养保健功能已为人所公认[1]，浙江康莱特药业有限公司生产的抗癌药物康莱特注射液以薏苡仁油为主要原料，已在临床中广泛应用[2,3].

目前文献报道的关于薏苡仁油的提取方法基本上是采用有机溶剂回流提取法[4-6]，但一般都存在着提取步骤多、操作复杂、污染环境、产品质量难以保证等问题.超声波具有热效应、机械效应和空化效应[7,8]，利用超声波可以强化溶剂提取过程，缩短提取时间，减少溶剂用量，提高提取得率.本实验采用超声强化提取薏苡仁油，并对影响因素进行了研究，确定最佳提取条件.

现代药理研究表明薏苡仁中的具抗肿瘤的活性成分为甘油三酯类组分，其中甘油三油酸酯含量较高且性质稳定，为更好地控制抗肿瘤药物薏苡仁原料的质量，本实验建立了薏苡仁中甘油三酯类主要成分甘油三油酸酯的含量测定方法，用于控制原料的质量.提取方法简单，含量测定方法准确、可靠、重复性好，可作为市场上薏苡仁药材的质量评价手段.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪，包括1525型二元梯度色谱泵、2420型蒸发光散射检测器、Empower色谱工作站(美国Waters公司).超声波清洗器(KQ-250DE型)，江苏省昆山市超声仪器有限公司.精密电子天平(万分之一)，上海精密仪器有限公司.

乙腈、二氯甲烷均为色谱纯.乙醇、正己烷、石油醚、氯仿、丙酮均为分析纯.

甘油三油酸酯对照品(批号111692，标示纯度为99%以上，上海时代生物科技有限公司)

12批不同来源薏苡仁(S1重庆、S2福建、S3广东、S4广西、S5贵州、S6河北、S7辽宁、S8陕西、S9山东、S10山西、S11四川、S12浙江，均为市售品).

1.2 试验方法

1.2.1 超声提取法

称取40～60目薏苡仁粉适量，加入一定量提取溶剂，置于超声仪内超声提取，分别考察提取溶剂、提取温度、材料粒径、提取时间等因素对薏苡仁油脂提取率的影响，其他具体实验参数为：提取时间30 min，料液比1∶10，提取温度40 ℃，超声频率与功率为25 kHz和300 W[9].超声完毕，过滤，滤液蒸干，用适量丙酮溶解转移至已称质量的干燥瓶中，自然挥干丙酮，精密称定质量并计算油脂的得率.

1.2.2 HPLC法测定甘油三油酸酯的含量

(1)色谱条件

Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相为乙腈-二氯甲烷(60∶40)；流速为1.0 mL/min；2420蒸发光散射检测器，漂移管温度70 ℃，氮气压力35 psi，雾化器温度35 ℃，增益为2[10].

(2)供试品溶液的制备

精密称定薏苡仁粉0.6 g(大于80目)，加入丙酮50 mL，称重，浸泡2 h，超声40 min，超声温度为50 ℃，取出，放冷，用丙酮补足重量，摇匀，静置，用0.45μm的微孔滤膜过滤，即得.

(3)对照品溶液的制备

精密称取甘油三油酸酯对照品适量， 加丙酮制成0.15 mg/mL的溶液，即得.

2 结果与讨论

2.1 超声提取条件的确定

2.1.1 超声提取溶剂的确定

称取40～60目薏苡仁粉5份，每份10 g，分别加入95%乙醇、正己烷、石油醚、氯仿、 丙酮为提取溶剂，通过比较这些溶剂的超声提取效果，确定超声提取薏苡仁油的溶剂.具体的实验参数同1.2.1，各溶剂提油率分别为2.78%、2.96%、4.33%、4.60%、5.60%，丙酮的提油率明显高于其他溶剂，故以丙酮作溶剂为宜.

2.1.2 超声提取温度的确定

以丙酮为提取溶剂，分别在30 ℃、40 ℃、及50 ℃、60 ℃进行超声提取实验，其他实验参数同1.2.1，考察温度的变化对超声提取的影响.由图1可看出温度对薏苡仁油提取率具有一定的影响，随着提取温度的升高，提取速率增大，油提取率有一定程度的提高，在30 ℃～60 ℃的温度范围内，50 ℃、60 ℃时薏苡仁油的提取率比较高，相差不大，选择50 ℃为最佳提取温度.

图1 超声提取温度对提取率的影响

2.1.3 薏苡仁粒径的确定

以丙酮为提取溶剂，分别采用粒径为20～40、40～60、60～80目以及大于80目的薏苡仁进行超声提取试验，超声提取温度为50℃，其他实验参数同1.2.1，从而考察薏苡仁粒径的变化对超声提取的影响.实验结果见图2，表明粒径对超声提取薏苡仁油的影响很明显，随着粒径的增小，提取率有明显的提高.最终确定薏苡仁粉碎至大于80目的粒径.

图2 原料粒径对提取率的影响

为了更快更完全地浸出有效成分，在薏苡仁预处理时,必须尽量破坏细胞结构，使薏苡仁粒径尽可能小，尽量使薏苡仁油成为游离状态，同时薏苡仁应该具有必要的机械结构性能，以保证在粒子和粒子内部之间良好的溶剂渗透.

2.1.4 超声提取时间的确定

薏苡仁粒径为40～60目，超声提取温度为50 ℃，其他实验参数同1.2.1，提取时间分别为10、20、30、40、50 min，通过薏苡仁油提取率的变化考察超声提取时间的影响.图3为超声提取时间对提取率的影响，表明随着超声提取时间从10 min增加到40 min，提取率随之增加；当提取时间超过40 min时，随着超声提取时间的延长，提取达到平衡后，薏苡仁油提取率基本保持不变.最终确定超声提取时间为40 min.

图3 超声提取时间对提取率的影响

2.2 HPLC法含量测定结果

2.2.1 标准加入法定位甘油三油酸酯

精密吸取一定量标准品溶液加入S8供试品溶液中，比较加入前后的样品色谱图，峰面积明显增大的峰即为甘油三油酸酯峰.由图4可知，在保留时间为23 min左右的色谱峰明显增高，峰面积明显变大，由此确定甘油三油酸酯的峰为图中23 min左右时所出色谱峰.该色谱峰左右对称，峰形良好，附近无其他色谱峰干扰，可以用于该成分的准确定量.

图4 添加与未添加甘油三油酸酯标准品的薏苡仁样品HPLC图A. 添加甘油三油酸酯标准品的薏苡仁样品；B. 薏苡仁样品； 1. 甘油三油酸酯

2.2.2 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液2，5，10，15，20μL分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线.通过最小二乘法得到回归方程为Y=6991.2x-491.02，线性相关系数r=0.998 3，结果显示进样量在0.241～2.416μg范围内有良好的线性关系[11].

2.2.3 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液20μL连续进样3次，测定峰面积值和保留时间，峰面积相对标准偏差为2.15%，保留时间相对标准偏差为1.65%.

2.2.4 重复性试验

取S8样品，按1.2.2项下方法制备3份供试品溶液，并按该项下的色谱条件进行测定，测定峰面积值和保留时间，峰面积的相对标准偏差为4.23%，保留时间的相对标准偏差为2.10%.

2.2.5 稳定性试验

取同一份供试品溶液，在制备好后每隔一定时间(0 h，4 h，8 h，16 h，32 h)按上述色谱条件进样分析，考察色谱峰的峰面积和保留时间，相对标准偏差均小于3.0%，确定32 h内基本稳定[12].

2.2.6 加样回收试验

精密称取3份已知含量样品粉末0.3 g(精确至0.000 1)，分别精密加入甘油三油酸酯对照品15 mL，使加入的对照品甘油三油酸酯的量与薏苡仁粉末中的该物质含量基本相同，按供试品溶液方法制备，测定峰面积并计算含量.平均回收率为101.42%，RSD=2.6%.

2.2.7 样品的含量测定

按1.2.2项下供试品溶液制备方法制备不同来源的12批薏苡仁供试品溶液，按该项下色谱条件分别注入高效液相色谱仪分析，12批不同来源薏苡仁供试品溶液色谱叠加图见图5，各批薏苡仁中甘油三油酸酯的含量结果见表1.12批不同来源的薏苡仁中甘油三油酸酯含量有一些差异，多数样品中甘油三油酸酯的含量均超过0.8%，其中购自广东药材市场和四川泸州百姓药房的薏苡仁含量最高达1.2%，其外观质硬有光泽，色白，颗粒饱满，只有购自沈阳寿康大药房、太原仁和大药房的样品含量较低，分别为0.686%、0.636%，色泽不太白，可能储存时间过长，质量较差.

图5 12批不同来源薏苡仁供试品HPLC叠加图

编号来源平均含量/%相对标准偏差/%(n=3)S1重庆海华医药超市0.8320.5S2福建江南益寿堂0.8540.8S3广东药材市场1.2601.3S4广西佳禾大药房0.8930.6S5贵州老百姓大药房0.7501.0S6河北祁奥中药饮片有限公司0.8450.9S7沈阳寿康大药房0.6861.4S8西安老百姓大药房0.8731.1S9济南鲁能超市0.9320.9S10太原仁和大药房0.6360.6S11四川泸州百姓药房1.2892.1S12浙江慈福堂医药0.8281.2

2.3 讨论

2.3.1 提取方法的确定

大多数植物油脂的提取属于液-固萃取过程，萃取效果主要由原料粒度和溶剂的性质决定.在原料粒度固定的情况下，在不同提取方法中由于提取过程中传质和传热机理的不同，其提取效率也有很大的差别.实验前期比较了超声、回流和索氏提取三种方法应用不同溶剂对薏苡仁油提取率的影响，结果以丙酮超声提取既方便且提取效率高.原因可能是丙酮极性较大，介电常数也较大，对能量吸收作用好，在超声波作用下，分子运动频率和速度都有所增强，因而其穿透能力也相应增强，能有效提高有效成分的溶出速度而有利于提取.

2.3.2 流动相的选择

采用HPLC法对甘油三油酸酯含量测定方法的研究中，在色谱条件优化时曾试用流动相为乙腈-二氯甲烷(65∶35)的比例及流速0.8 mL/min，均因分离效果不好或费时而没有采用，最终综合考虑基线噪音、出峰时间和分离效果等因素，调整流动相比例为乙腈-二氯甲烷(60∶40)，流速为1 mL/min[13].

2.3.3 检测器的确定

由于甘油三酯类成分在紫外区基本无吸收，采用紫外检测器需对样品进行衍生化处理[14]，存在测试周期较长、操作成本较高和前处理过程繁杂等缺点，采用蒸发光散射检测器提高了灵敏度，对样品无紫外吸收的要求，在本试验最优色谱条件及检测条件下各色谱峰分离效果良好.

3 结论

采用丙酮超声强化提取薏苡仁油，方法简单、快速、提取效率高.同时采用HPLC-ELSD法测定甘油三油酸酯的含量，在最优色谱条件下，甘油三油酸酯的线性范围为0.241～2.410μg，相关系数为0.996 3.该含量测定方法操作简便、灵敏度高、重现性好，样品测定结果准确可靠，可以用于评价不同来源中药薏苡仁及其他含有甘油三酯类成分药材的内在质量.

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