大蒜种质超低温保存及脱毒技术研究进展

刘晓雪 程智慧

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）

大蒜（Allium sativumL.）为百合科（Liliaceae）葱属二年生草本植物，营养繁 殖，一般无有性世代，或不能开花结籽。因此，用鳞芽作种质资源保存，需要年年到田间繁殖更新，既占用大量土地资源，耗费人力物力，又不利于种质稳定性的保持。而且，在自然条件下，植株及鳞茎有可能遭受病虫害的侵袭而丧失种质的特性，不 便于种质的管理、交换与发放。

超低温保存是指在-80℃以下的超低温环境中保存种质资源，是20世纪70年代发展起来的一套现代生物学保存技术（Nag & Street，1973）。常以液氮（-196℃）为冷源，因此超低温保存又称液氮保存。近年来，超低温保存作为一种植物种质离体保存新技术，以其设备要求简单，处理步骤相对简便，效果和重演性好等优点，成为种质保存研究的热点（Sakai & Engelmann，2007）。

大蒜在每年的营养繁殖过程中，容易感染病毒并积累在鳞茎中随 世代传递，引发病毒病（Ayabe & Sumi，2001）。病毒病易导致大蒜种性退化，鳞茎商品品质降低，甚至很多从国外引进的新优品种，也因病毒侵染种性退化，品质降低而再不能用于大蒜商品生产，造成巨大经济损失，严重制约了 大蒜产业的发展。

传统大蒜脱毒方法包括茎尖培养、热处理结合茎尖培养、茎尖二次培养、茎尖微体嫁接、愈伤组织培养等方法。茎尖培养实际操作难度大；通过愈伤组织途径分化出芽长成植株也可获得无毒苗，但是再生植株遗传变异率较高。与传统脱毒方法相比，超低温法具有植株脱毒率高，操作简便，再生植株遗传稳定性好，增殖率高且能与超低温保存种质结合利用等明显优势 （Wang et al.，2006；Feng et al.，2010）。

1 植物超低温保存及脱毒原理

1.1 超低温保存原理

在超低温条件下，几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止，但细胞活力和形态发生的潜能却可保存，因而细胞培养物的遗传稳定性得以保证（Kartha & Engelmann，1994）。超低温保存原理一般基于以下两大理论：

① 细胞冰冻与伤害理论。生物细胞在降温过程中只要降温速率低于脱水的连续性，细胞内水分就会不断向胞外扩散，原生质体浓缩，从而降低细胞内含物冰点。这种逐渐除去细胞内水分的过程称为保护性脱水（Protective dehydration）。但是过度脱水会使细胞内有毒物质积累，破坏蛋白质和酶的结构，膜的完整性受到伤害。除此之外，如果胞内结冰，还会造成机械伤害（Ice injury）。超低温保存就是以避免产生这两种伤害为目的 （王培忠 等，2007）。

② 溶液的玻璃化理论。玻璃化（Vitrification）是指一个生物物理学过程——细胞和溶液在快速降温时进入一种均一的无定形状态，细胞内的水不形成冰而进入过冷液体状态，是一种对细胞损伤最小的状态（Rall & Fahy，1985）。Luyet（1937）认为，液体有两种固 化方式，一是不连续地固化成晶体；二是连续固化成非晶体，进入玻璃化状态。这时液体实际上还是液态存在形式，且不会对组织和细胞造成机械伤害。植物种质超低温保存成功的关键是要避免细胞、组织内结冰，使之发生玻璃化，以安全地贮存。

任何液体只要有足够的降温速度都可进入玻璃态。例如要使纯水玻璃化，降温速度需高达1010℃·s-1，这用常规的冷却速度是难以达到的。通过添加高浓度的冰冻保护剂可以显著降低液体进入玻璃态所需的降温速度（李广武，1998），促进保存材料组织在结冰早期进行保护性脱水，阻止冰晶生长，从而使之较易达到玻璃化状态。

1.2 超低温脱毒原理

利用超低温方法脱毒的材料多为植物茎尖。Feng 等（2010）认为供试茎尖经超低温冻存后，其最顶端以及第1、2 叶原基由于细胞核与细胞质体积比例大，内含物质浓度高，细胞内空泡少且维管组织发育不全，因此能够经受住低温而存活下来。而这部分组织病原物含量较少甚至不含病原物。与此同时茎尖下部其余部分因细胞较成熟，水分含量多而易被冻死，这部分组织多含有大量病原物。最终，经过超低温处理，含有病原物的组织冻伤坏死，而不含病原物的组织存活下来，继续分裂分化形成脱毒植株。

2 大蒜种质超低温保存研究现状

超低温作为种质保存和脱毒的一种新方法，已经应用于多种植物上，包括马铃薯（Wang et al.，2006）、甘薯（Pennycooke & Towill，2000；Feng et al.，2010）、百合（Chen et al.，2011）、菊花（Hitmi et al.，1997；Halmagyi et al.，2004）、苹果（Paul et al.，2000）等。大蒜超低温研究多集中在超低温保存体系的建立上。

超低温保存按其降温冰冻方式不同，有多种不同方法，包括早期的慢速冰冻法、快速冰冻法、分步降温法、干燥冰冻法等，以及目前多采用的玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法（马千全 等，2007；吴昀 等，2012）。已有的研究采用的大蒜材料主要是鳞芽茎尖，也有报道用气生鳞茎和未成熟花序作为外植体材料。所采用的超低温方法以基于玻璃化的玻璃化法和小滴玻璃化法为主，尚未见其他超低温方法用于大蒜种质保存的报道。

2.1 超低温保存材料的选择

由于超低温保存对材料降温速率的特殊要求，因此所选材料需具有体积小、再生能力强且分化程度低的特征，一般选择茎尖分生组织作为超低温保存材料。

对大蒜的超低温保存而言，传统且常见的保存材料为大蒜鳞芽茎尖（Makowska et al.，1999；Baek et al.，2003；Kim et al.，2004，2006，2007；王 艳 军 等，2005；徐 培 文 等，2005）。Baek 等（2003）对大蒜茎尖进行了超低温保存，结果发现外植体来源与大小对冻后材料的存活率及再生率都有很大影响。在最适条件下，茎尖再生率可达90%以上。另有报道采用玻璃化法冻存大蒜胚性愈伤组织，最高存活率为30%（Sudarmonowati，2001）。但因这种材料冻后存活率低且遗传稳定性较差，一直未得到普遍采用。

近年来，国外学者开始尝试采用大蒜其他材料进行超低温保存。Kim 等（2007）比较了大蒜鳞茎茎尖、未成熟花序、成熟的气生鳞茎及独头蒜茎尖等材料的超低温保存效果，认为未成熟花序具有污染率低、冻后幼苗成苗快等优点。Makowska 等（1999）比较研究了鳞芽茎尖和气生鳞茎两种材料的超低温保存效果，表明鳞芽茎尖存活率和再生率均高于气生鳞茎，但气生鳞茎冻后一致性好且污染率低。Keller 等（2010）又以大蒜未成熟花序基部为材料进行超低温保存，认为未成熟花序基部具有直接取材、无需离体扩繁、污染率低等优点。

虽然目前鳞芽茎尖仍被研究者广泛用于大蒜超低温保存，但其茎尖剥取有一定难度，费时费力，因此不便于大蒜超低温技术的推广应用。采用气生鳞茎作材料，尽管一致性好，污染率低，但冻后存活率和再生率较低是其最大缺陷。而未成熟花序基部作为超低温保存材料，不仅具有操作容易、污染率低等优点，同时具有较高存活率和再生率，是大蒜超低温保存极具应用潜力的新型材料。

2.2 超低温保存方法的选择

目前植物超低温保存方法以玻璃化法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法为主。在大蒜超低温保存中，玻璃化法研究最多（Makowska et al.，1999；Baek et al.，2003；Kim et al.，2004，2007；Volk et al.，2004；王艳军 等，2005；Ellis et al.，2006；Keller et al.，2010），但Keller等（2010）研究证明小滴玻璃化法保存大蒜茎尖，其存活率、再生率均高于玻璃化法。Kim 等（2006）利用小滴玻璃化法保存大蒜茎尖，再生率可达77.4%～95.4%。

相较于传统的玻璃化法，小滴玻璃化法适用于对脱水及冷刺激较不敏感的植物材料，且具有降温速率快、冻后成活率高等优点，是适于大蒜种质超低温保存的一种方法。

2.3 玻璃化溶液的选择

在植物超低温保存研究中，常用的玻璃化 溶液，即PVS（Plant Vitrification Solution）主要有3种：PVS2〔30% 甘油+15% 乙二醇+15% 二甲亚砜（DMSO）+0.4 mol·L-1蔗糖+MS 液体培养基〕、PVS3（50% 甘油+50% 蔗糖+MS 液体培养基）和PVS4（35% 甘油+20% 乙二醇+0.6 mol·L-1蔗糖+MS 液体培养基）（Sakai & Engelmann，2007）。其中，PVS2 和PVS3 在大蒜中应用最普遍。

Kim 等（2004）研究表明，PVS3 是保存大蒜最有效的玻璃化溶液，用PVS3处理150～180 min，大蒜再生率可达92%。Makowska 等（1999）研究证明使用PVS3 溶液保存大蒜效果优于PVS2。Keller 等（2010）研究发现，PVS3 确实对大蒜超低温保存具有良好效果，PVS4 则没有效果，不能用于大蒜超低温保存。Ellis 等（2006）研究发现PVS2 和PVS3 保存大蒜种质效果无明显差异。

PVS3 与PVS2 相比，不含二甲亚砜和乙二醇两种成分，虽然脱水效果不如PVS2，但对材料的毒害作用较小。因此，在大蒜超低温保存中，较为理想的玻璃化溶液是PVS3。

2.4 影响超低温保存效果的因素

超低温保存植物研究中，植物冻后存活率和再生率不仅与超低温体系各个步骤的优化有关，还会受植物基因型的影响。同种植物不同基因型和品种，其超低温保存效果往往差异很大。

Volk 等（2004）利用AFLP 标记区别出不同基因型的美国大蒜资源用于超低温保存试验，以研究大蒜不同基因型对超低温冻存的反应。结果虽然不同基因型之间存活率和再生率差异显著，但将超低温应用于不同基因型的大蒜资源保存是可行的。

王艳军等（2005）用山东苍山大蒜进行了超低温保存研究，存活率最高达到100%。Kim 等（2004）超低温保存了10个大蒜品种，再生率为72%～95%。Kim 等（2007）超低温保存韩国大蒜品种超过930个，平均存活率79.9%，再生率78.2%。在大蒜超低温保存体系研究中，目前还没有一个广泛适用于大蒜 各种基因型的完整体系。

除材料基因型对超低温保存效果有很大影响以外，其田间生长过程中的生理状态以及采收后保存等条件也是重要影响因素。

英国Lynch 等（2010）认为大蒜超低温保存的重点在于确定各大蒜品种在生长季节和超低温保存后再生长的生理变化。因为收获后贮存体系和贮存时间影响组织培养条件下大蒜材料的反应。Kim 等（2004）研究发现，采后贮藏3个月或6个月后再进行超低温保存的大蒜再生率最高。

总之，影响大蒜超低温保存效果的因素纷繁复杂，还需要进行大量的研究工作才能阐明其中的规律，探索出一条能够广泛用于大蒜超低温保存的完整体系。

3 大蒜脱毒研究

我国及世界大蒜主产区的主栽大蒜品种和品系往往受多种病毒复合侵染，洋葱黄矮病毒（OYDV）、韭葱黄条斑病毒（LYSV）和洋葱螨传潜隐病毒（OMBFV）是主要病毒种类。青葱潜隐病毒（SLV）、大蒜普通潜隐病毒（GCLV）和马铃薯Y 病毒组的侵染率较低，其发病程度与地区纬度有关，可能受栽培地区的气温、光照条件及毒源的影响（徐培文 等，1999）。

早在1973年Havránek（1973）通过培养0.4～0.5 mm 茎尖获得脱除大蒜花叶病毒（GMV）的植株以来，世界各国研究者进行了很多大蒜脱毒方面的研究。目前常用技术主要有：茎尖培养、温热处理、花序轴离体培养、茎盘培养及茎盘圆顶结构培养等（赵心爱和薛庆中，2002）。

3.1 脱毒材料

大蒜脱毒传统材料为茎尖分生组织，Sant 等（1982）用0.4～0.9 mm 茎尖培养获得了脱毒大蒜植株。Walkey 等（1987）以茎尖分生组织为材料培养获得大蒜，脱毒率为25%～50%。Martin 等（1995）用ELISA 检测出4种大蒜病毒，并以茎尖为材料培养获得对不同病毒的脱毒效果：大蒜普通潜隐病毒脱毒率62%，韭葱黄条斑病毒脱毒率100%，洋葱黄矮病毒脱毒率92%，洋葱螨传潜隐病毒脱毒率54%以下。研究还发现，用于脱毒的茎尖分生组织越小，脱毒效果越好，但材料＜0.4 mm时无法再生。Bertaccini 等（2004）以茎尖分生组织为材料进行脱毒培养，RT-PCR检测结果表明对大蒜螨传病毒的脱毒率为27%。

由于以茎尖分生组织为材料进行脱毒培养对材料大小要求严格，茎尖较小操作起来较为困难且脱毒率较低。因此有研究者开始采用大蒜其他部位的材料进行脱毒研究。

Wang 等（1994）以大蒜花茎顶端为材料进行脱毒培养，脱毒率为77.6%，高于含3个叶原基的茎尖培养（26.5%）和含1～2个叶原基的茎尖培养（45.4%）。Ayabe 和Sumi（2001）以大蒜茎盘为材料进行脱毒培养，RT-PCR 和免疫组织印迹法检测发现，在培养过程中病毒被脱除；电镜观察不同发育阶段组织表明，脱毒可能与维管束结构阶段发育有关。Haque 等（2007）以2～3 mm 大蒜根尖分生组织为材料进行脱毒研究，经RT-PCR检测：根尖分生组织培养能够有效脱除大蒜主要病毒，是可用于大蒜脱毒的一种高效新型材料。

3.2 脱毒方法

目前大蒜脱毒常用的方法主要是基于植物组织培养技术的茎尖培养，也有茎尖培养结合热处理进行脱毒的报道，化学处理脱毒效果较差。

Walkey 等（1987）研究发现，若在组织培养前将材料进行38℃处理，可使脱毒率从25%提高到85%。Ramírez-Malagón 等（2006）比较了温热处理、化学处理和分生组织培养对Taiwan和Chileno 两个大蒜品种的脱毒效果，脱毒率温热处理分别为63% 和70.9%，化学处理分别为27%和34.8%，分生组织培养均为64%。

3.3 脱毒苗的应用

大蒜脱毒研究主要集中于脱毒材料及方法的选择，脱毒试管苗繁育及田间表现的研究报道较少。Xu 等（1994）优化了大蒜茎尖培养脱毒试管苗及移栽田间后的管理，并使用气生鳞茎进行无毒苗扩繁，提高了大蒜脱毒苗的增殖系数，为脱毒苗的生产应用提供了依据。

3.4 超低温处理与大蒜脱毒

与传统脱毒方法相比，超低温处理具有植株脱毒率高、操作简便、再生植株遗传稳定性好且增殖率高等明显优势，同时能与超低温保存种质相结合，既保存了种质又能获得无毒种苗（Wang et al.，2006）。目前，超低温脱毒技术在很多植物上都有应用，包 括黄瓜（Helliot et al.，2002）、葡萄（Wang et al.，2003）、马铃薯（Wang et al.，2006）、甘薯（Feng et al.，2010）、香蕉及一些果树砧木（Brison et al.，1997）等的脱毒。Wang 等（2006）研究表明：马铃薯经超低温脱毒后，马铃薯卷叶病毒（PLRV）和马铃薯Y 病毒（PVY）的脱毒率分别可达83%～86%和91%～95%，高于分生组织培养（56% 和62%）和温热处理脱毒（50% 和 65%），与温热处理结合分生组织脱毒率相近（90%和93%）。证明超低温处理作为脱毒的新方法，不仅脱毒效率高且操作简便。

目前国内外对大蒜脱毒方法及其效果的研究多采用茎尖分生组织培养、温热处理、茎盘培养和花茎顶端培养等传统组织培养方法。应用超低温处理进行大蒜脱毒研究的相关报道很少，目前仅有韩国Kim 等（2007）用RT-PCR检测表明，一些被病毒感染的大蒜材料经超低温保存后再生的幼苗病毒量减少，而系统的研究尚未见报道。

4 存在问题与展望

超低温技术作为一项大蒜种质资源保存及脱毒的新技术，尽管有着显而易见的优势，但由于其研究起步较晚，加之很多内在机理尚未揭示，至今仍有很多亟待解决的问题。

4.1 取材方面

在现有的大蒜超低温研究中主要材料为大蒜茎尖。而这种材料存在一定问题。首先是材料不足，大蒜茎尖可供切取的数目有限，往往不能满足超低温保存的要求，而且从鳞芽中剥取茎尖操作难度也较大；其次是材料来源，鳞芽来源于土壤，土壤环境比较复杂，导致所取材料极有可能沾染一些病原物，如细菌、真菌、病毒和昆虫类。这给随后的组织培养带来了一定困难：如果消毒不彻底，带菌材料的存活率会受到影响，从而影响超低温保存的效率；消毒过度又会引起材料的损伤，同样也对材料存活率有不利影响。

已有研究开始尝试将大蒜气生鳞茎、未成熟花序等材料用于超低温保存。此外，还可通过茎盘或花序轴诱导生成大蒜不定芽或侧芽，既解决了材料少的问题，又降低了茎尖剥取的难度，提高了效率。同时由于不定芽体系在离体无菌条件下建立，因此可排除病原物的干扰，降低试材污染率。随后的研究可以在取材方面进行进一步的探索，如蒜薹顶端分生组织——花序轴也可用于超低温保存，以及如何提高大蒜不定芽的增殖系数等。

4.2 遗传稳定性检测方面

现有研究中对大蒜超低温冻存后材料的遗传稳定性检测虽有涉及，但研究都不系统。而且普遍采用的检测方法多侧重于分子、染色体等微观层面。因此对试材再生后田间种植的植株表现及生态 适应性等宏观表型因素需要进一步分析，以明确超低温冻存对大蒜生理生态方面产生的效应。

4.3 超低温脱毒方面

目前大蒜超低温研究多集中于对超低温保存程序的建立和优化。大蒜病毒病是生产上急需解决的问题之一。因此，需进行超低温脱除大蒜主要病毒的研究，为繁育大蒜脱毒苗，保持优良品种种性，解决实际生产问题开辟新的途径。

4.4 超低温保存体系优化方面

大蒜超低温保存程序根据其品种的不同，同一品种取材部位的不同，乃至所选用的超低温冻存方法的不同而存在很大差异，且经冻存后大蒜的存活率和再生率结果差异也较大。目前尚未建立起具有广泛适用性的大蒜超低温保存体系。

因此，在今后的研究中，应着力研发广泛适用于不同大蒜品种，且具有稳定存活率和再生率的超低温保存体系，为该项技术投入生产实践奠定基础。

此外，大蒜超低温保存过程中的组织细胞超微结构变化尚未见报道。超低温冻存过程涉及一系列细胞冻融的物理化学变化，这些变化势必会引起细胞结构方面的变化。

研究这些细胞水平的结构变化对于深入了解超低温保存技术的实质，揭示其内在规律，从而有目的地优化大蒜超低温保存体系有重要意义。在以后的研究中，可通过扫描电镜、透射电镜、光谱分析法、差热分析法及核磁共振等方法进行此类问题的探索。

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