红花色素的荧光性能

李学琴，程建文，魏玲，徐家宁，范勇

（1.昌吉学院化学与应用化学系，新疆昌吉831100；2.吉林大学化学学院，吉林长春130012）

红花属菊科，现今主要栽种于新疆、甘肃、河南、浙江、四川等地，其中新疆是我国种植历史最悠久，种植面积最大的红花产地之一，品种资源占到全国的50%以上。红花中主要含有红色素和黄色素，其中红色素含量约占0.1%～0.2%，黄色素含量为30%左右[1]。

红花色素在医药、化妆品、食品等领域都有广泛的应用。目前对红花色素分析的主要方法有，分光光度法[2-3]、高效液相色谱法[4-5]、荧光分析法[6]。其中荧光分析法具有操作简单、灵敏度高等特点。本文采用荧光分析法分别对红花红色素和红花黄色素分别进行研究，研究pH、温度、溶剂、金属离子对红花红色素和红花黄色素荧光性能的影响，为以后的探索研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

RF-5301 荧光分光光度计：日本岛津；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：上海嘉鹏科技有限公司；KQ-100型超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；XYJ-802离心成淀机：江苏医疗仪器厂；HR-200 电子天平：A&D Company，Limited；微量取液器：北京青云航天仪表有限公司。

红花：新疆产，粉碎（过120 目筛）；丙酮：分析纯，天津市北方天医化学试剂厂；氢氧化钠：分析纯，西安化学试剂厂；硫酸：分析纯，乌鲁木齐市天岳化学试剂有限公司；硫酸亚铁：分析纯，上海第二钢铁厂；氯化铝：分析纯，北京市朝阳区化肥厂；硝酸铅：分析纯，北京红星化工厂；硫酸铵：分析纯，成都化学试剂厂。

1.2 方法与步骤

1.2.1 红花红、黄色素的处理

取2 g 红花粉末，经蒸馏水多次浸泡，超声振荡过滤，收集滤渣，合并滤液，该滤液作为黄色素待测液。滤渣晾干后用50%丙酮溶液浸泡，重复提取3 次，滤渣呈土黄色，合并滤液，该滤液作为红花红色素待测液。

1.2.2 红色素荧光分析条件的选择

取10 mL 比色管，加入红色素样品滤液3 mL，用50%丙酮溶液定容、摇匀。在220 nm～780 nm 间扫描得知样品溶液的最佳激发波长和发射波长（λex=365 nm，λem=735 nm）。

1.2.2.1 红花红色素在50%丙酮溶剂中的荧光性能

50%丙酮溶剂，在激发波长λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的扫描范围条件下，测定50%丙酮溶剂荧光性能。用同样的方法，取3 mL 的50%丙酮提取液，测提取液的荧光性能。

1.2.2.2 荧光分析中红色素用量的选取

取9 种不同浓度的溶液，在激发波长λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的扫描范围条件下，测定不同浓度红花红色素的荧光性能。

1.2.2.3 温度对红花红色素荧光性能的影响

取4 只10 mL 比色管，各加入5.2.1 的红色素滤液3 mL，然后各加入50%丙酮溶液7 mL，搅匀。将试管放入水浴锅中，温度控制在25、35、50、65 ℃条件下水浴2 min，然后冷却至室温。分别取上述4 种不同温度的溶液各3L，置荧光分析皿中，在λex=365nm，在700nm～750 nm 的扫描范围条件下测定不同温度环境下红花红色素的荧光性能。

1.2.2.4 pH 对红花红色素荧光性能的影响

取10 只比色管，各加入50%丙酮溶液7 mL，用0.2 moL/L 氢氧化钠和0.1 moL/L 硫酸溶液分别调节酸碱度使10 只比色管中的pH 从1～10 排列，再分别加入5.2.1 的红色素滤液3 mL，摇匀。取上述10 种不同pH 的溶液各3 mL，置荧光分析皿中，在λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的扫描范围条件下测定不同pH 环境下红花红色素的荧光性能。

1.2.2.5 金属离子对红花红色素荧光性能的影响

取4 只10 mL 比色管，分别加入1.2.1 的红色素滤液3 mL，然后将等量的0.01 moL/L 金属化合物（FeSO4，AlCl3，Pb（NO3）2）及硫酸铵溶液加入相应的比色管中，用50%丙酮溶液定容，摇匀。分别取上述4 种含不同盐的溶液3 mL，在λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的扫描范围条件下测定红花红色素的荧光性能。

1.2.3 黄色素荧光分析条件的选择

黄色素水溶液，在220 nm～780n m 之间扫描，得知样品溶液的最佳激发波长和发射波长λex= 242 nm，λem=485 nm。

1.2.3.1 红花黄色素在水作溶剂中的荧光性能

取3 mL 的蒸馏水，在激发波长λex= 242 nm，在460 nm～550 nm 的扫描范围条件下，测定蒸馏水荧光性能。用同样的方法，取3 mL 的水提取液，测提取液的荧光性能。

1.2.3.2 荧光分析中黄色素用量的选取

在室温条件下，分别系列浓度的黄色素提取液，用荧光分光光度计扫描，激发波长λex=242 nm，扫描范围在460 nm～550 nm 得到黄色素用量—荧光强度曲线。

1.2.3.3 温度对红花黄色素荧光性能的影响

黄色素水提取液，控制在25、35、50、65、80、90 ℃等温度下水浴2 min，冷却至室温。在激发波长λex=242 nm，扫描范围：460 nm～550 nm 条件下测定不同温度环境下红花黄色素的荧光性能。

1.2.3.4 pH 对红花黄色素荧光性能的影响

黄色素样品滤液40 μL，用0.2 moL/L 氢氧化钠和0.1 moL/L 硫酸溶液分别调节蒸馏水酸碱度pH 从1～10，室温下在激发波长λex= 242 nm，扫描范围：460 nm～550 nm 条件下测定不同pH 环境下红花黄色素的荧光性能。

1.2.3.5 金属离子对红花黄色素荧光性能影响

取3 只10 mL 比色管，分别加入黄色素样品滤液120 μL，将等量0.01 moL/L 金属化合物[FeSO4，AlCl3，Pb（NO3）2]加到相应的比色管中，用蒸馏水定容，摇匀。分别取上述3 种含不同金属离子的溶液3mL，室温下在激发波长λex=242 nm，扫描范围：460 nm～550 nm 条件下测定黄色素的荧光性能。

2 结果与讨论

2.1 红花红色素50%丙酮溶液荧光性能

取3 mL 的50%丙酮溶剂，在激发波长λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的扫描范围条件下，测定50%丙酮溶剂的荧光性能。用同样的方法，取3 mL 的50%丙酮提取液，置于荧光分析皿中，测定提取液的荧光性能见，图1。

图1 50%丙酮溶剂中红花红色素荧光性能Fig.1 Fluorescentspectral properties of the carthamine in 50%acetone

由图1 可知，50%丙酮溶剂在700 nm～750 nm 波长范围内没有出现波峰，表明在735 nm 处的波峰是由红色素产生的，50%丙酮溶剂对红花红色素的荧光性能没有影响。

2.2 荧光分析中红色素用量的选取

取9 只试管，各加入1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL 50%的丙酮溶液，再各加入1.2.1 的红色素提取液3 mL，摇匀。取9 种不同浓度的溶液3 mL，在激发波长λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的扫描范围条件下，测定不同浓度红花红色素的荧光性能，见图2。

图2 红色素用量对红色素荧光性能的影响Fig.2 Effect of carthamine content to fluorescent spectral properties

从图2 可知，分别用1 mL 到7 mL 的50%丙酮溶液稀释3 mL 红色素提取液，红色素发出的荧光强度逐渐增强，用7 mL 的50%丙酮溶液稀释时，红色素的荧光强度最达到最强。而用8、9 mL 的50%丙酮溶液稀释时，红色素的荧光强度逐渐减弱。推测其原因：红色素浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光猝灭现象。

2.3 温度对红花红色素荧光性能的影响

取4 只10 mL 比色管，各加入1.2.1 的滤液3 mL，用50%丙酮溶液定容搅匀。将比色管放入水浴锅中，温度控制在25、35、50、65 ℃条件下水浴2 min，然后冷却至室温。分别取上述4 种不同温度的溶液各3 mL，在λex=365 nm，在700 nm～750 nm 的扫描范围条件下测定不同温度环境下红花红色素的荧光性能，见图3。

图3 温度对红色素荧光性能的影响Fig.3 Effect of temperature to fluorescent spectral propertiesof the carthamine

从图3 可以看出，随着温度的升高红色素的荧光强度逐渐减弱，其中65 ℃时红色素发出的荧光强度最弱，25 ℃时红色素发出的荧光强度最强。推测其可能的原因是，温度升高时，介质黏度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。

2.4 pH 对红花红色素荧光性能的影响

取10 只比色管，各加入50%丙酮溶液7 mL，用0.2 moL/L 氢氧化钠和0.1 moL/L 硫酸溶液分别调节酸碱度使10 只比色管中的pH 从1～10 排列，再分别加入1.2.1 的红色素滤液3 mL，摇匀。取上述10 种不同pH 的溶液各3 mL，在λex=365 nm，在700 nm～750 nm的扫描范围条件下测定不同pH 环境下红花红色素的荧光性能，见图4。

图4 pH 对红色素荧光性能的影响Fig.4 Effect of pH to fluorescent spectral propertiesof the carthamine

由图4 得知，红花红色素溶液pH 从1 到10 的荧光强度逐渐减弱，且pH=1 时，红花红色素的荧光强度最强。推测其原因：由于分子内存在氢键作用，使分子结构呈多环状。pH=1 时，质子化作用比较强，使得氢键的键能增强，致使整个分子结构的刚性增强，所以在pH=1 时红色素的荧光强度最强。

2.5 金属离子对红花红色素荧光性能影响

取4 只10 mL 比色管，分别加入1.2.1 的红色素滤液3 mL，然后将等量的0.01 moL/L 金属化合物[FeSO4，AlCl3，Pb（NO3）2]及硫酸铵溶液加入相应的试管中，用50%丙酮溶液定容，摇匀。分别取上述4 种含不同盐的溶液3 mL，在λex=365 nm，700 nm～750 nm 的扫描范围条件下测定红花红色素的荧光性能，见图5。

图5 金属离子对红花红色素荧光性能的影响Fig.5 Effect of metal ion to fluorescent spectral propertiesof the carthamine

由图5 可知，Pb2+、Al3+、Fe2+离子的存在，使得红花红色素的荧光性能增强。一般而言，铝离子可能与红色素形成配合物，使红色素分子结构发生变化，峰位发生变化，重金属离子会使物质的荧光性能产生猝灭现象，但实验得出的结果却正好相反，峰位没有发生变化，而重金属离子使红色素的荧光性能增强。而（NH4）2SO4的影响不大，为以后用硫酸铵/丙酮双水相提取红花红色素提供参考。

2.6 水溶剂对红花黄色素荧光性能的影响

取3 mL 的蒸馏水，在激发波长λex=242 nm，在460 nm～550 nm 的扫描范围条件下，测定蒸馏水的荧光性能。用同样的方法，取3 mL 的水溶剂提取液，置于荧光分析皿中，测定提取液的荧光性能，见图6。

图6 水作溶剂中红花黄色素荧光性Fig.6 Fluorescentspectral properties of safflower yellow in water

由图6 得知，水作溶剂在460 nm～550 nm 波长扫描范围内没有出现波峰，表明在485 nm 处的波峰是由黄色素产生的。

2.7 荧光分析中黄色素用量的选取

取5 只10 mL 比色管，用微量取液器分别加黄色素提取液60、90、120、150、180 μL 于比色管中，再用蒸馏水定容。在室温条件下，分别取上述五种浓度的溶液各3 mL，激发波长λex=242 nm，扫描范围在460 nm～550 nm 得到一系列荧光发射曲线，见图7。

图7 黄色素用量对荧光性能的影响Fig.7 Effect of safflower yellowcontent to fluorescent spectral properties

由图7 可知，提取液用量为120 μL 时红花黄色素发出的荧光强度最强。当用量大于120 μL 时荧光强度呈减弱的趋势，推测其原因黄色素浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光自熄灭现象。

2.8 温度对红花黄色素荧光性能的影响

取6 只10 mL 比色管，分别加入黄色素样品滤液120 μL，用蒸馏水定容，摇匀。将比色管放入水浴锅中，温度控制在25、35、50、65、80、90 ℃等温度下水浴2 min，冷却至室温。分别取上述六种温度的溶液各3mL，在激发波长λex=242 nm，扫描范围：460 nm～550 nm 条件下测定不同温度环境下红花黄色素的荧光性能，见图8。

图8 温度对红花黄色素荧光性能的影响Fig.8 Effect of temperature to fluorescent spectral propertiesof safflower yellow

由图8 可知，随着温度的提高红花黄色素的荧光强度逐渐减弱，其中90 ℃时黄色素发出的荧光强度最弱，25 ℃时黄色素发出的荧光强度最强。推测其可能的原因是，温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。

2.9 pH 对红花黄色素荧光性能的影响

取10 只100 mL 玻璃烧杯，各加入蒸馏水50 mL，用0.2 moL/L 氢氧化钠和0.1 moL/L 硫酸溶液分别调节酸碱度使10 只烧杯中的pH 从1～10 排列，分别取上述10 种不同pH 的溶液各3 mL，各加入黄色素样品滤液40 μL，室温下在激发波长λex=242 nm，扫描范围：460 nm～550 nm 条件下测定不同pH 环境下红花黄色素的荧光性能，见图9。

图9 pH 对黄色素荧光性能的影响Fig.9 Effect of pH to fluorescent spectral propertiesofsafflower yellow

由图9 可知，黄色素溶液的pH 在1～3 时，溶液的荧光性能逐渐增强，pH=3 时荧光强度达到最大。黄色素溶液的pH 在3～10 时，溶液的荧光强度逐渐减弱。推测其原因：黄色素溶液的pH 减小，因质子化作用-O（C5H11O5）变成-OH+（C5H11O5），使得左端的氧吸电子作用增强，与羰基间位连接的C=C 双键发生断裂，羰基间位的C 与-OH+（C5H11O5）左端的氧形成新键，从而形成一个环状结构，此时羰基临位的C 显正电性，容易发生烯醇互变异构现象，使得环状结构刚性增强，荧光性能也较强，当pH＜3 时使得环上的-OH 容易形成-OH2+发生脱落，给电子基团减少，所以荧光性能较弱。

2.10 金属离子对红花黄色素荧光特性的影响

取3 只10 mL 比色管，分别加入黄色素样品滤液120 μL，将等量0.01 moL/L 金属化合物[FeSO4，AlCl3，Pb（NO3）2]加到相应的比色管中，用蒸馏水定容，摇匀。分别取上述3 种含不同金属离子的溶液3 mL，室温下在激发波长λex=242 nm，扫描范围：460 nm～550 nm 条件下测定红花黄色素的荧光特性，见图10。

图10 金属离子对红花黄色素荧光特性的影响Fig.10 Effect of metal ion to fluorescent spectral propertiesof the carthamine

由图10 可知，Pb2+、Al3+、Fe2+离子的存在，使得红花黄色素的荧光性能增强，推测其原因：一般而言，铝离子可能与黄色素形成配合物，使黄色素分子结构发生变化，导致峰位发生变化；而重金属离子会使物质的荧光性能产生猝灭现象，但实验得出的结果却正好相反，峰位没有发生变化，且重金属离子使黄色素的荧光性能增强。

3 结论

本实验分别提取红花红、黄色素，分别进行荧光分析性能检测，分析溶剂、温度、pH、金属离子对红花红、黄色素荧光性能的影响。实验结果如下。

1）红花红色素50%丙酮溶液荧光性能实验研究结果表明：λex=365 nm，λem=735 nm，在pH=1，温度25 ℃时，红花红色素荧光强度最大，金属离子（Fe2+、Pb2+、Al3+）使红色素荧光性能增强，而（NH4）2SO4对红花红色素荧光性能的影响不大。

2）红花黄色素水溶剂荧光性能实验研究结果表明：λex=242 nm，λem=485 nm，在pH=3、温度25 ℃时，红花黄色素荧光强最大，金属离子（Fe2+、Pb2+、Al3+）使黄色素荧光性能增强。而文献报道[10]中红花甲醇提取液荧光性能研究结果为：λex=340 nm，λem=440 nm，红花色素在pH=12 的碱性环境中所发出的荧光强度达到最大。

[1] 吴德意.红花红色素的提取工艺及产品质量控制[J].化工进展,2003,22(1):26-28

[2] 朱文明.红花黄色素的提取精制及稳定性研究[D].合肥工业大学,2007:1-47

[3] 许钢.天然红花黄色素稳定性研究[J].食品工业科技,2000,21(1):16-18

[4] 王慧琴,谢明勇,付博强,等.RP-HPLC 法测定红花中红色素的含量[J].分析测试学报,2004,11(2):98-100

[5] 刘月庆,王睿,毕开顺.HPLC 法测定红花中黄色素A 的含量[J].药物分析杂志,2004,24(4):356-357

[6] 葛尔宁,张毅璇.红花及番红花色素的荧光特性分析[J].浙江中医学院学报,2005,29(6):85-86