医学真菌基因组学研究进展 (上)

占萍 王冲 刘维达

(北京协和医学院，中国医学科学院皮肤病研究所真菌科，南京 210042)

基因组学是近代科学界最突出的前沿性科学之一，带动了生命科学领域日新月异的变革。1996年完成的对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)全基因组测序，不仅是酵母菌的一个革命性的里程碑，也激起了真核生物基因功能和表达的全球性研究［1］。近年来全基因组测序 (whole genome sequencing，WGS)技术应用于医学研究后，医学真菌的研究也从单个基因水平迅速提高到了大规模、群体和组学研究水平，为人类认识真菌的遗传进化、致病机制、真菌病防治等各个方面提供了新视野和新捷径。本文就医学真菌基因组学及相关测序技术发展历史及现状、研究内容以及其应用价值进行综述。

1 医学真菌基因组学发展历史

1986年美国科学家Thomas Rodefick首先提出“基因组学”概念，紧接着的“人类基因组计划”带动了模式生物和其他重要生物体基因组学的研究［2］。阐明各种生物基因组DNA中碱基对的序列信息及破译相关遗传信息的基因组学已经成为与生物学和医学研究不可分割的学科。1996年，由欧洲、美国、加拿大和日本等近百个实验室合作，首次完成第一个真核生物酿酒酵母的基因组测序［1］。而2002年和2003年完成的Schizosaccharomyces pombe和Neurospora crassa基因组的研究显示酿酒酵母作为真菌模式生物的局限性［3-4］。这些研究尚未涉及到致病真菌，但是为后者WGS的研究提供了思路和方法。

2000年由美国Broad研究所与真菌学研究团体发起真菌基因组行动 (fungal genome initiative，FGI)，目的是促进在医药、农业和工业上具有重要作用的真菌代表性物种的全基因组测序。2002年5月FGI发布了第一份关于测定15种真菌基因组计划的白皮书。2003年6月，该组织发布第二份白皮书，列出44种重要真菌作为测序的目标，强调对其中 10个属即青霉 (Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、组织胞浆菌 (Histoplasma)、球孢子菌 (Coccidioides)、镰刀菌 (Fusarium)、脉孢菌 (Neurospora)、念珠菌 (Candida)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、 隐 球 酵 母(Cryptococcus)和柄锈病菌(Puccinia)的物种优先进行测序［2］。之后，于2011年11月11日启动了“1000基因组计划”(1000 fungal genomes)。参与单位包括多个著名大学、国家级研究机构及知名生物公司，如圣约翰大学、加利福尼亚大学、美国能源部联合基因组研究所 (JGI DOE)、美国Broad研究所、法国国家农业研究所INRA、英国Sanger研究所、Monsanto、Syngenta、Biozentrum、Bayer Crop Science AG和Exelixis等著名公司。该项目计划在未来5 a时间内将1 000多种真菌进行全基因组测序和注释。选择的种类以Hibbett 2007描绘的真菌进化树“Assembly the Fungal Tree of Life”为框架，覆盖了目前发现的生命树上140个目 (order)550个科(family)内所有重要真菌，旨在通过丰富的真菌基因组信息，帮助人类详尽而深入的了解真菌信息，包括其生物多态性、遗传进化关系、植物-微生物相互作用、微生物散射 (microbial emission)、温室效应、环境宏基因组学等。目前，真菌的注释基因组学已经开始启动，对全球开放了未知菌的基因组注释平台。以上内容及其他相关信息可在多个研究机构的网站上实时查询，如http://www.broadinstitute.org/，http://1000.fungalgenomes.org 和 http://genome.jgi.doe.gov/programs/fungi/genome-releases.jsf等。

2 基因组测序技术的发展

第一代基因测序方法主要有链终止法和化学降解法。前者是1977年由英国化学家Frederick Sanger发明，他利用该技术成功测出Φ-X174噬菌体的基因组序列，这是首次完整的基因组测序工作，具有里程碑意义，成为人类基因组计划等研究得以开展的前提之一。由于Sanger的突出贡献，他于1980年再次获得诺贝尔化学奖。与此同时，Maxam和Gilbert两位化学家发明了化学降解法。但由于Sanger法既简便又快速，经过后续的不断改良，成为了上世纪末DNA测序的主流，直到现在，该方法仍旧广泛应用于小、中片段DNA片段测序。后来发展起来的荧光标记技术和毛细管电泳技术，使测序方法全自动化，大大提高了测序效率。人类基因组计划的绝大部分工作运用第一代测序技术完成［5］。

第二代测序技术伴随着计算机技术的高速发展而来，其核心思想是“边合成边测序”(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche公司的454平台、Illumina公司Solexa和ABI公司SOLID系统。这三个技术平台各有优缺点，Roche454的测序效率最高，Solexa测序低成本高性价比，而SOLID测序的准确度最高。第二代测序技术不需要引物，高通量和高速度，但价格昂贵，结果分析复杂，需要专门的技术人员和软件。第二代测序仪中，只有Roche454技术能独立完成真核生物基因组的从头测序工作，Solexa和SOLID技术则只能完成简单生物如细菌的基因组的从头测序。在真核生物测序过程中，可以将454技术与Solexa/SOLID或与传统的Sanger测序技术结合，分别利用它们的高通量和较长读长的优势，大大降低测序成本，提高测序速度和效率［5-7］。

近来，以单分子测序为特点的第三代DNA测序技术已经出现，如BioScience公司的单分子测序仪(HeliScope Single Molecular Sequencer)以及正在研制的Pacific Biosciences的单分子实时DNA测序技术［Single Molecule Real Time(SMRT)DNA sequencing technology］和 Oxford Nanopore Technologies lad的纳米单分子测序技术等。其中最受关注的为纳米技术，其基本原理是利用纳米技术直接读取核酸分子上不同碱基侧链进行测序，但目前还处于研发阶段，预计样机2013年可以推出，以将人类基因组测序的成本降到1 000美元以下为终极目标。届时，医学真菌的研究将进一步获益，先进低廉的测序技术使得医学真菌领域的科学家花较少的钱就可以对自己熟悉的物种基因组进行测序，从而更好地指导试验设计，取得更多新发现［5，8］。

DNA测序技术的快速发展，改变了医学视野，昭示着个体化医疗世纪的来临，人类站在了一个全新的历史转折点，如果能测定社区中每个个体的全基因组序列，储存于国家公共卫生系统，这将大大方便易感基因检测和个体化诊疗。测序成本降低是WGS技术推向医疗个体化的重要前提。事实上，测定DNA系列的成本已经每年内2～3次下降，而效率呈指数级升高。1990年开始的“人类基因组计划”，原计划多国合作、花15 a时间、30亿美元完成了人体4万个基因30亿个碱基对的测定，在上世纪末已提前完成了人类基因组草图。1995年自动化测序仪出现，单台仪器的测序速度提高到每天100 000 bp，每一个碱基的成本降至1美元。1998年ABI 3700 DNA自动化测序仪问世，测定一个碱基0.1美元，测序速度提高到每天900 000 bp。2008年，同样还是ABI 3700，平均每个碱基的成本是0.008美元。在医学真菌领域，基因组测序从逐步克隆到全基因组鸟枪法 (whole genome shotgun)策略，同样呈现效率不断提高而成本显著下降的趋势。1996年，斯坦福大学基因技术中心开始对白念珠菌SC5314进行全基因组鸟枪法测序，到2003年完成了10.7×的基因序列图，相关文章2005年发表于《PNAS》，历时近十年。而如今，运用新一代测序仪Roche 454检测一个20 Mb的真菌基因组花费仅需要2～3个月时间，约10万人民币。尽管如此，该费用和周期仍旧超出绝大多数科学家和患者的承受能力，需要不断改进，应凭借样本微量化、多通道平行测序等方法，实现测序高通量。有望在未来数年内，单细胞测序方法将会指数级提高效率，真正实现个体化医疗［5-7］。

3 基因组学研究内容

基因组学研究内容主要包括结构基因组学、比较基因组学和功能基因组学的研究。结构基因组以全基因组测序为目的，包括物理作图、核苷酸序列分析等，其基本方法与其他微生物相同。而大量独特的医学真菌信息则来自于比较基因组和功能基因组学的研究，在此仅介绍后面两类。

3.1 比较基因组学

比较基因组学是在结构基因组学基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，以了解基因的功能、表达和物种进化的学科。医学真菌基因数据的分析，需要与已知的真核模式菌株和相近的种属的DNA序列进行比较，发现其相似及不同之点，以揭示菌种进化关系、致病菌的致病机制、寻找可能的新的抗真菌药物靶点。

2007年，Cornell等比较了34种真菌全基因组，这是首次对真核类生物进行最广泛的比较基因组学分析，其中包括子囊菌 (Ascomycete)、担子菌(Basidiomycete)和结合菌 (Zygomycete)。另外还采用了2个卵菌(Oomycetes)的基因组数据，后者已从真菌分化出去，但在生物活性上显示出与植物真菌病原菌趋同进化特点。分析发现这些基因组从2.5～40 Mb大小不等，开放读码框 (ORFs)1 996～17 467个。其中微孢子虫Encephalitozoon cuniculi基因组最小，而子囊菌Pezizomycotina最大，一般序列多者编码框多，但不尽然，基因组大小并不与编码框数量成正比。该研究以现有的基因组数据为基础，探讨相关序列的基因簇和进化关系，揭示了一些前人所未见的真菌的功能及生化多样性现象［9］。

白念珠菌为第一个被测序的医学真菌。在其数据分析初期，其参照菌为酿酒酵母，由此发现了白念珠菌一些特殊之处:富含短序列重复片段，其脂类和氨基酸降解酶的组成更为复杂;长度大于16 kb的重复片度(major repeat sequence，MRS)广泛分布于每条染色体(除外染色体3)上。与酿酒酵母相比，两者仅64%的序列相同，并不高于白念珠菌与人及其他进化关系较远的酵母菌的序列同源性;同样，两者染色体也不具有高度同线性;在全基因组和线粒体基因组，均存在代谢上较大的差异;白念珠菌存在毒力相关的一些大的基因家族(如ALS)、铁转运蛋白、分泌型天冬氨酸蛋白酶和脂酶等。这些比较基因学获得的信息，初步揭示了白念珠菌作为医学真菌的独特致病性［10-11］。

都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)是目前知道的在进化上与白念珠菌最靠近的菌种，两者共有诸多相近的形态学特点。但是，临床上都柏林念珠菌致病性远小于白念珠菌。通过比较这两者的基因组信息，也许可以发现一些白念珠菌特异的毒力因子。2009年9月，都柏林全基因组被测序，与已知的白念系列相比，发现两者在基因组序列上具有高度的一致性，如共有168个种特异性基因包括编码菌丝的基因 (天门氨酸蛋白酶sap 4和sap 5)和侵袭素als 3等，都柏林的115个假基因也与白念菌丝生长调节素 (filamentous growth regulator，FGR)基因同源，而菌丝生长是白念主要的致病机制之一。两者差异在于:白念具有一些独特的基因现象，如全基因组内广泛存在的TLO(一种转录子)基因家族扩展和膜转运蛋白IFA家族，这些代表了白念珠菌新的候选毒力相关因子;白念珠菌一些基因发生了倒置、插入缺失和移位，破坏了基因的高度同线性，这些细小的变异影响了白念珠菌的致病能力，如SAP基因家族，在白念对宿主的各个病理过程中均是重要的致病因子。都柏林缺乏了四个sap位点中的2个。总之，虽然都柏林和白念珠菌具有高度一致同源性，但两者在近期的进化是截然不同的，白念珠菌的基因家族变得更为复杂和精细，导致其致病能力大大增强［12］。

同样，对同一菌种不同特点的菌株WGS信息比较中，也可以发现其致病毒力因子。新生隐球菌进行全基因组测序时，采用的是两个临床菌株:JEC21和B-3501，两者均为血清D型，但后者比前者更能耐受高温，在动物模型上显示更强的致病性。比较基因组数据发现，B-3501株具有鸟苷三磷酸酶激活蛋白和两个功能未知的特异性蛋白，而JEC21则具有另外4个功能未知的特异基因，还具有22个复制片段。科学家由此假设这些基因参与了该菌的致病过程，当然最终结论还需要进一步研究［13］。

3.2 功能基因组学

功能基因组学又称“后基因组学”(Postgenomics)，它利用结构基因组所提供的信息和产物来了解基因功能。其研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测等。研究的传统手段包括经典的减法杂交、差示筛选、cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析，新一代的技术包括基因表达的系统分析 (serial analysis of gene expression，SAGE)、cDNA 微阵列 (cDNA microarray)、DNA芯片 (DNA chip)、序列标志片段显示(sequence tagged fragments display)技术和微流控芯片实验室等［14］。

烟曲霉的致病相关基因编码的蛋白参与基础代谢、信号传递、胞壁合成、色素合成以及调控二级代谢产物等非常复杂的机制，因此，对曲霉功能的研究不能单纯依靠分析基因结构，而是采用了微阵列方法。比如，为研究烟曲霉对热适应的能力，构建了不同温度下 (30℃、37℃和48℃)的基因表达谱，结果显示，在不同的温度水平，烟曲霉表达的基因谱类似，但是基因表达量存在差异。在10个与该功能相关的基因簇中，簇1和簇2共含有323个基因，其中有与高温耐受有关的多个热休克蛋白相关基因，这类基因在48℃时表达比37℃时明显增高。而含有135个基因的簇3则刚好相反，37℃时表达量更高。这些温度依赖性基因散在分布于烟曲霉全基因组。另外，微阵列分析也发现，与酿酒酵母相比，在各种应急情况下，烟曲霉表达的基因存在差异，有些甚至完全相反。这些数据显示，烟曲霉的致病机制及抵抗机体能力与酵母菌是不同的［15-16］。

针对新生隐球菌全基因组序列，也获得一个庞大的cDNA文库，共包括23 000个cDNA克隆。基因表达谱发现，新生隐球菌结构比其他已知基因组序列的子囊菌复杂得多;存在选择性剪接和内源性反义转录，这些均与基因调节机制相关。新生隐球菌一个重要的毒力因子为夹膜多糖，这也是其独特的致病因子，结构复杂，具有流动性，在侵袭人体时发挥着重要的功能。新生隐球菌有50个以上细胞壁甘露糖蛋白编码基因，其中大多数为该菌所特有。与酿酒酵母相比，两者在细胞壁的蛋白联系上有很大的不同，酿酒酵母主要通过PIR蛋白和GPI锚定蛋白共价键结合于细胞壁，但这两类蛋白在新生隐球菌均缺失［17］。

4 医学真菌基因组学的应用

4.1 生物学特性和生物多样性研究

自然界的真菌超过150万种，致病菌在500种左右，借助对真菌基因组数据进行分析，可以了解不同真菌的生物学特征和进化多态性机制。曲霉是一类具有生物学多态性的一种真菌，其中包括以制药和食品工业为代表的米曲霉 (A.oryzae)，引起人类动物致病的烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉 (A.nidulans)和黄曲霉 (A.flavus)等，而绝大部分曲霉广泛存在自然界，对人类不产生危害。为何不同的曲霉具有如此大的区别呢?还有，烟曲霉作为一种自然界广泛存在的寄生菌，为何具有侵袭人体的毒力，而此现象并不常见于其他丝状菌中?科学家们一直试图通过各种手段如基因缺失来探讨其原因。早期基因突变的研究发现了一些与烟曲霉致病相关的基因，如:pyr G，pks P，sid A，lae A等。但这些基因在真菌的基础代谢中起重要作用，暗示烟曲霉侵袭人体时这些基因并不是真正的毒力因子，比较基因组学的发展为这种研究提供了的捷径。烟曲霉为第一个被测序的丝状医学真菌。将烟曲霉基因组序列与白念珠菌和新生隐球菌相比，发现该菌与酵母菌共有序列不多。与酵母菌相比，烟曲霉细胞壁缺乏酵母细胞壁上的β-1，6-葡聚糖和肽聚甘露聚糖，也缺乏酵母细胞GPI锚定蛋白和PIR蛋白的同源物，这些结构在维持酵母细胞壁结构完整性中发挥重要作用。但是，在烟曲霉基因组序列中存在一类疏水蛋白，类似于GPI锚定蛋白，在真菌连接到疏水表面、提供立体结构以及孢子存活中占据重要地位。与其他无致病性或弱致病性的曲霉相比，烟曲霉基因组与构巢曲霉和米曲霉序列相差甚远。500多个特异性蛋白在后两者未发现同源物，其中1/3表现出与其他真菌产物的相似性，一些参与次级代谢物的生物合成［15］。烟曲霉进化相近的菌种为棒曲霉和Neosartorya fischeri，后者目前未发现引起人类疾病。科学家将烟曲霉 Af1163、Af293与N.fischeri和棒曲霉基因组系列进行对比，发现烟曲霉具有增强侵袭力的特殊的遗传决定因素。比如，其家系特异性基因(Lineage-specific genes)组成了烟曲霉85%的基因组，在棒曲霉和N.fischeri中没有同源物，而这些基因发挥着很多重要的生物学功能，如碳和氨基酸的代谢、转运、解毒和次级代谢产物的生物合成等。进一步研究发现，这些基因具有异质性，其基因长度和内含子数量差异很大，集中分布于亚染色体基因岛，这提示烟曲霉可能具有复杂的基因调节机制，使其适应外界迥然不同的外界环境，土壤和人体内都能存活［16］。

基于形态学的传统分类方法存在很多缺陷，使得目前学术界对真菌的分类学出现混乱场面。近年来基于基因组信息的数据，可以通过比较系列同源性来确定不同真菌的进化关系，比基于形态学来对真菌进行鉴定更科学可信。目前WGS已经用于细菌和病毒的流行病学分型，有望很快在医学真菌领域得到应用［17］。

人类皮肤黏膜定植着无数的微生物，包含大量的细菌、病毒和真菌，组成了每一个特定解剖部位的微生态，各成分间相互影响。宏基因组学(Metagenomics)又叫微生物环境基因组学，它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA即宏基因组(metagenomic)，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。该技术主要应用于研究环境微生物群落多样性，其应用的主要技术仍旧为第二代测序技术，最多见的为Roche454平台。理论上来说，宏基因组学比实时定量PCR等技术更尊重微生态原状，因为每一个集合均应该作为一种整体来研究，其中的微生物并不是独立存在的。宏基因组学中数据分析更为复杂，建立在非培养基础上的研究不仅缩短检测时间，还可以避免培养基的选择性培养等缺陷。这些研究将揭示不同生物个体间、不同解剖部位间和不同生理病理状态下的生物多样性。宏基因组学最初应用于生态和环境研究，目前在医学领域已被用于研究人类口腔和肠道微生态及抗生素抵抗的报道［18-20］。

4.2 研究真菌致病机理

将WGS数据与其前人的研究相结合，寻找可能的致病基因和家族，并借此发现更多的相关基因。另一方面，基因组发现的信息也可以被用来提出假设，针对一些可疑基因建立动物模型、细胞或组织模型，进一步发现和验证这些毒力因子，有助于加深人类去了解真菌与人类细胞相互作用、导致疾病的机制，从而更好地去治疗和预防该类疾病。

2012年，红色毛癣菌基因组和其他4种相关皮肤癣菌(断发毛癣菌、同心毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌)基因组被测定，分析显示皮肤癣菌富含LysM结构域，该结构域与结合细胞壁上的几丁质及相关糖类有关。皮肤癣菌也编码一系列真菌特异性激酶，但具体特异性功能未知，包括非功能性pseudokinases，后者可能与底物竞争结合位点，抑制磷酸化，发挥异位效应，或扮演信息通路中的信号分子。皮肤癣菌还富含大量合成二级代谢产物的酶类，如合成新的化合物的皮肤癣菌特异性基因;另外，皮肤癣还富含几类蛋白酶类，与其在角质层上生长或获得营养有关。这些基因组信息分析，大大有利于我们了解皮肤癣菌如何与角质细胞作用、应对机体免疫系统、引起皮肤慢性感染等机制［21］。

同样，在2011发表的亲动物性皮肤癣菌 (须癣毛癣菌与疣状皮肤癣菌)的WGS数据中，也发现了一些与其致病性相关基因，如较多的基因家族扩展现象，较其他真菌更富含合成二级代谢产物的基因簇，且均富含水解酶，包括降解角质的蛋白酶和脂解酶，这些编码基因与球孢子菌和烟曲霉存在数量和种类上的差异，考虑与皮肤癣菌的亲角质性相关［22］。进一步的研究发现了须癣毛癣菌hypA基因，编码细胞壁上HypA疏水蛋白，该蛋白为一种细胞表面优势蛋白，在真菌生长和出芽过程中也存在。体内和体外模型发现，该基因缺失后真菌的疏水性下降，激发人中性粒细胞和树突状细胞的能力增强，分泌 IL-6，IL-8，IL-10、TNF-α 等炎症因子的水平升高，导致人体杀伤真菌孢子的能力明显增强。该研究为探讨皮肤癣菌诱导皮肤细胞免疫耐受机制提供了参考［23］。

4.3 耐药与药物开发

长期抗真菌药物治疗会导致耐药，最常见的耐药是参与甾醇14α-脱甲基酶编码基因cyp 51以及参与药物外流泵的ABC(ATB-binding cassette)家族和MFS(Major Facilitator Superfamily)超家族。这些是唑类药物耐药机制研究的热点。但Camps等［24］最近通过全基因组测序方法发现了一种新的耐药机制 HapE P88L突变。hapE基因编码CCAAT-binding factor complex的亚单位Hap E，该复合物是一种原核基因转录因子，诱导前导链和反义链在启动子区特异性识别CCAAT原件。作者从一个长期接受唑类药物治疗的患者身上获得一序列敏感和耐药菌株 (相距17周)，然后通过Illumina de novo全基因组测序，证实不存在cyp 51和药物外流泵的突变，而存在hapE基因突变。作者将这两株菌的序列与其他两株已知全基因组序列的参考菌株两两比较，发现敏感株和耐药株间仅存在6个可能的蛋白编码区非同义突变。通过性别交叉试验发现，耐药的子代菌中由P88L亚基取代了HapE，而其他5个突变与耐药无关。进一步的hapE突变株显示烟曲霉明显的出芽减少和生长减速，并显示HapE P88L单个突变就能导致烟曲霉耐药［24］。

与此研究类似的报道，Singh-Babak等用WGS发现了对棘白菌素耐药的光滑念珠菌的9个非同义突变基因。进一步建立的体外和小鼠模型中，发现了与FKS2-T1987C相关的代偿性耐药机制，而分子伴侣Hsp90及其下游效应物磷酸酶可以消除棘白菌素抵抗现象［25］。

阐明耐药机制，发现新的代谢通路和作用靶点，可为开发抗真菌药物提供新的方向。在隐球菌与子囊菌的比较基因组中发现，很多隐球菌细胞壁合成的基因是保守的，与子囊菌相同，这种相似使得他们成为广谱抗真菌药物的理想作用靶点［16］。

5 医学真菌后基因组学展望

随着重要医学真菌不断被测定全基因组信息，该领域已经进入了后基因组时代，对大量数据进行分析和注释显得更为重要和复杂，对医学科学工作者提出了新的挑战。2012年12月31日，“1000 fungal genomes”项目组宣布:紧接着一个满意的开端之后，“1000 fungal genomes”工程掀开了新的一页，有50个全基因组正在准备之中。截止目前为止，626个科中的真菌，至少有1/4获得了一个样本的基因组序列，其中80个科有2个全基因组序列。自2013年开始，JGI网站对全球开放真菌注释工作。

［1］Goffeau A，Barrell BG，Bussey H，et al.Life with 6000 genes［J］.Science，1996，274(5287):546，563-567.

［2］余知和，高元钢，曾昭清，等.真菌基因组学研究进展［J］.菌物学报，2008，27(5):778-787.

［3］Wood V，Gwilliam R，Rajandream MA，et al.The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe［J］.Nature，2002，415(6874):871-880.

［4］Galagan JE，Calvo SE，Borkovich KA，et al.The genome sequence of the filamentous fungusNeurospora crassa［J］.Nature，2003 ，422(6934):859-868.

［5］解增言，林俊华，谭军，等.DNA测序技术的发展历史与最新进展［J］.生物技术通报，2010，13(8):64-70.

［6］Pettersson E，Lundeberg J，Ahmadian A.Generations of sequencing technologies［J］.Genomics.2009，93(2):105-111.

［7］刘蓉蓉.高等植物基因组测序回顾与展望［J］.生物医学通报，2011(5):10-14.

［8］Zhou X，Ren L，Meng Q，et al.The next-generation sequencing technology and application［J］.Protein Cell，2010，1(6):520-536.

［9］Cornell MJ，Alam I，Soanes DM，et al.Comparative genome analysis across a kingdom of eukaryotic organisms:Specialization and diversification in the Fungi［J］.Genome Res，2007 ，17(12):1809-1822.

［10］Jones T，Federspiel NA，Chibana H，et al.The diploid genome sequence ofCandida albicans［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(19):7329-7334.

［11］Odds FC，Brown AJ，Gow NA.Candida albicansgenome sequence:a platform for genomics in the absence of genetics［J］.Genome Biol，2004，5(7):230.

［12］Jackson AP，Gamble JA，Yeomans T，et al.Comparative genomics of the fungal pathogensCandida dubliniensisandCandida albicans［J］ Genome Res，2009，19(12):2231-2244.

［13］Loftus BJ，Fung E，Roncaglia P，et al.The genome of the basidiomycetous yeast and human pathogenCryptococcus neoformans［J］.Science，2005，307(5713):1321-1324.

［14］周冰炎，蒋玮莹.后基因组时代的功能基因组学［J］.国际遗传学杂志，2007，30(4):261-265.

［15］Nierman WC，Pain A，Anderson MJ，et al.Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungusAspergillus fumigatus［J］.Nature，2005，22:438(7071):1151-1156.

［16］Fedorova ND，Khaldi N，Joardar VS，et al.Genomic islands in the pathogenic filamentous fungusAspergillus fumigatus.PLoS Genet，2008，11，4(4):e1000046.

［17］Kser CU，Ellington MJ，Cartwright EJ，et al.Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology［J］.PLoS Pathog，2012，8(8):e1002824.

［18］Baquero F.Metagenomic epidemiology:a public health need for the control of antimicrobial resistance［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18(Suppl 4):67-73.

［19］Alcaraz LD，Belda-Ferre P，Cabrera-Rubio R，et al.Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18(Suppl 4):54-57.

［20］Gosalbes MJ，Abellan JJ，Durbán A，et al.Metagenomics of human microbiome:beyond 16s rDNA［J］.Clin Microbiol Infect，2012 ，18(Suppl 4):47-49.

［21］Martinez DA，Oliver BG，Grser Y，et al.Comparative genome analysis ofTrichophyton rubrumand related dermatophytes reveals Candidate genes involved in infection［J］.MBio，2012，3(5):e00259-212.

［22］Burmester A，Shelest E，Glckner G，et al.Comparative and functional genomics provide insights into the pathogenicity of dermatophytic fungi［J］.Genome Biol，2011，12(1):R7.

［23］Heddergott C，Bruns S，Nietzsche S，et al.The Arthroderma benhamiae hydrophobin HypA mediates hydrophobicity and influences recognition by human immune effector cells［J］.Eukaryot Cell，2012 ，11(5):673-682.

［24］Camps SM，Dutilh BE，Arendrup MC，et al.Discovery of a hapE mutation thatcausesazoleresistanceinAspergillus fumigatusthrough whole genome sequencing and sexual crossing［J］.PLoS One，2012，7(11):e50034.

［25］Singh-Babak SD，Babak T，Diezmann S，et al.Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance inCandida glabrata［J］.PLoS Pathog，2012，8(5):e1002718.