腰椎间盘退变基因治疗的研究进展

李 翔，李新志

腰椎间盘退变 (LDD)是引起一系列脊柱疾病的主要原因，但现有的保守治疗及手术治疗均是针对患者临床症状［1］，并不真正符合LDD的发病机制及病理生理学特点。为寻求更好的治疗方法，基因治疗逐渐进入人们的视线并成为近些年研究的热点。LDD基因治疗主要涉及目的基因的筛选、载体的选择、转染方法和转基因的表达调控等，现就其研究进展综述如下。

1 基因治疗的必要性

LDD是由基因因素和环境因素相互作用的多因素疾病。Battié等［2－3］对不同环境下成长的同卵双胞胎进行的长期研究显示，LDD可能主要受遗传因素的影响，环境因素的影响可能非常有限。Patel等［4］通过人口数据库系统对犹他州的1 264例LDD患者进行健康和家谱分析，发现LDD患者有明显的家族聚集性。Kepler等［5］认为许多特定的遗传风险基因与LDD密切相关，个人发生LDD风险的75%可归因于遗传因素。传统观点认为基因治疗主要针对的是经典遗传性疾病，但基因治疗技术的进步揭示了其在后天获得性慢性疾病中的潜在用途。由LDD引发的腰椎疾病也是基因治疗的良好适应证［6］。基因治疗的主要方法是利用载体将治疗性基因转染到靶细胞内，转基因细胞就会持续产生治疗所需的产物。虽然基因治疗的技术要求复杂，但一旦成熟应用于临床，可以想象，一次基因或蛋白因子注射会给患者带来多么大的好处。

2 目的基因

对于基因治疗而言，找到与疾病发生发展密切相关的目的基因是关键问题。目前，常用候选基因的方法来识别与LDD相关的目的基因，并发挥了一定的作用。目前研究热门的候选基因主要有以下几种。

2.1 细胞外基质蛋白 (ASPN)基因

ASPN基因因与骨关节炎相关而成为LDD的候选基因。Song等［7］应用微点阵和原位杂交技术对中国和日本LDD队列进行了研究，发现ASPN基因的表达随年龄增长和腰椎间盘的退变而升高，其中D14基因型占多数，且与LDD具有高度相关性。荟萃分析结果显示，在两个队列中，个人携带至少一个D14等位基因发生LDD风险的比值比分别为1.66和1.79，表明东亚人群ASPN基因与LDD密切相关。

2.2 软骨中间层蛋白 (CILP)基因

CILP是关节软骨的重要结构，与骨关节炎密切相关。Wang等［8］利用兔子腰椎退变动物模型对CILP基因在腰椎间盘组织中的表达和表达调节机制进行研究表明，正常情况下CILP基因在兔子腰椎间盘组织中高表达，其表达水平随兔龄增长及腰椎间盘的退变程度加重而持续上调;骨形态发生蛋白 －2(BMP－2)通过激发CILP基因启动子的活性诱导CILP的表达，并且兔龄越大诱导作用越强。用基因干扰技术对表达Smad1蛋白的基因进行敲除，则BMP－2对CILP的诱导作用消失。据此推测，LDD程度、年龄和BMP－2均能对 CILP基因的表达进行调节，而BMP－2对CILP表达的调节作用则通过激活Smad1信号通路来实现，探讨基因表达的调节机制也是研究LDD基因治疗的重要方向。

2.3 骨形态发生蛋白 (BMP)基因

BMP是一种多功能生长因子，是具有成骨诱导作用的特殊蛋白质，可以刺激间充质干细胞分化为多种细胞。BMP家族成员众多，目前研究较多的是BMP－2基因。Leckie等［9］采取穿刺造模并体内注射的方法，以2型腺病毒相关病毒为载体并装载BMP－2基因，对兔腰椎间盘细胞进行转染，并将其作为治疗组，另设空白对照组;通过MRI检查和组织学检查证明两组兔子均因穿刺而造成LDD，在12周时，治疗组腰椎间盘内Ⅱ型胶原含量迅速增加，组织学形态也得到恢复，而对照组却无此现象。提示BMP－2基因治疗或许可作为LDD的一种治疗手段。

2.4 生长分化因子－5(GDF－5)基因

既往研究认为GDF－5基因与骨骼的生长发育有关，但近年研究发现其与骨骼高度及膝骨关节炎密切相关［10］，因而成为了LDD的候选基因。Williams等［11］对北欧人群进行的大样本量荟萃分析结果证实，含GDF－5 T等位基因的北欧女性更容易发生腰椎间隙变窄和骨赘，与LDD密切相关。Liang等［12］利用腺病毒作为载体，将分别搭载了 GDF－5基因 (治疗组)和荧光素酶基因 (对照组)的腺病毒注射到LDD小鼠腰椎间盘，2周后，治疗组小鼠的椎间高度持续增加，组织学检查结果显示治疗组小鼠腰椎间盘的组织学结构明显改善，而对照组无明显改善。提示GDF－5基因可能是恢复退变腰椎间盘功能的候选基因。

3 载体

通常情况下，外源性基因很难被靶细胞所接受，这就需要载体把治疗性基因转导入靶细胞内，载体一般分两种，即病毒性载体和非病毒性载体。

3.1 病毒性载体 病毒是非常高效的载体，因此，在进行基因治疗研究时通常选用病毒作为载体，如慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒 (AAV)等。虽然研究表明此类载体基本上是安全的，但人们还是对其表示担忧。

3.1.1 慢病毒载体 慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒 (HIV－1)为基础的基因治疗载体，目前研究较多［13］。HIV－1型慢病毒载体具有容纳较大外源性基因片段、可瞬时表达、相关指标便于检测、表达稳定、转基因细胞株方便通过抗生素筛选等优点，且引起宿主的免疫反应小，安全性较好。胡明等［14］利用慢病毒为载体将干扰片段 (siRNA)转染人胚腰椎间盘髓核细胞，并使髓核细胞的上皮膜蛋白－1基因表达沉默，成功构建了人胚腰椎间盘髓核上皮膜蛋白－1基因低表达细胞模型。

3.1.2 腺病毒载体 腺病毒载体是目前在转基因研究领域应用较广的病毒载体之一。Liang等［12］通过体内针刺注射的办法将分别搭载了荧光素酶基因和GDF－5基因的腺病毒载体注射到小鼠腰椎间盘，然后分别在1、2、4、8周后处死小鼠并进行腰椎间盘组织学和生化检测;结果显示，腺病毒存活且能高效地向腰椎间盘细胞内转导目的基因，转基因表达持续6周以上。表明腺病毒可能是LDD基因治疗的合适载体。

3.1.3 AAV载体 研究认为，AAV载体较腺病毒载体具有更少的免疫原性，目前为止仍未发现其与人类或哺乳动物的任何疾病有关，且AAV载体的大小可根据搭载基因的性状进行调节。Lattermann等［15］将携带不同标记基因的AAV载体注射到24只兔子腰椎间盘组织，并对转基因的表达及机体对AAV载体的细胞体液免疫进行评估，结果显示，AAV载体能高效地转导腰椎间盘细胞并产生了很好的转基因表达作用，即使是在一个低水平的体液免疫环境下，总转基因效率约相当于腺病毒载体的50%。出于人们对腺病毒载体安全问题的担忧，AAV载体可能是更好的病毒性载体。

3.2 非病毒性载体 非病毒性载体介导的基因转染技术较病毒性载体更为安全、简单［16］，但非病毒性载体的转染率较病毒性载体低，而超声微泡技术及脂质体技术等的出现极大地提高了非病毒性载体的转染率。

3.2.1 超声微泡技术 超声微泡技术是近年应用于基因治疗的非病毒性载体技术之一，其利用超声微泡造影剂携带药物或外源性基因进入靶点，再在超声环境下使其破裂并释放药物或基因。Nishida等［17］将分别加载了绿色荧光蛋白 (GFP)和荧光素酶的质粒与超声微泡造影剂混合，注入SD大鼠腰椎间盘后将超声施加于注射部位 (超声组)，同时设置空白对照组，于1、3、6、12、24周后处死大鼠，将切下的髓核组织用于转基因评估，以正常腰椎间盘组织作对照;结果显示，基因转染7 d后就能在GFP转染的髓核观察到相当数量的GFP阳性细胞，超声组荧光素酶活性约是空白对照组的11倍，且该方法介导的转基因表达至少持续24周。Nishida等［17］进行的研究也是第一次以非病毒性载体在体内进行转染腰椎间盘细胞的报道，说明超声微泡技术在LDD基因治疗中具有很大的潜在作用。

3.2.2 脂质体 脂质体是近年应用较多的非病毒性载体，其主要成分是磷脂，与细胞膜中的天然脂质膜具有非常相似的生物学特性［18］。脂质体具有良好的生物相容性、生物降解性，且无免疫原性，是一种对受体细胞无明显毒性的人工组装囊泡。脂质体制剂对人体的安全性已获得美国食品药品监督管理局的认同。Morrey等［19］对多种脂质体相关载体进行了筛选，通过对它们在体外对腰椎间盘的细胞毒性、转染率以及适宜转染条件进行观察发现，脂质体与蛋白质和多胺复合体(TransIT－LT1)可能是LDD基因治疗比较好的非病毒性载体。

4 RNA干扰 (RNAi)技术

腰椎间盘是体内最大的无血管组织，其髓核被密封在两端为终板软骨、四周为致密纤维环的“密闭”空间。腰椎间盘营养物质和氧的供给主要通过终板软骨被动扩散，这导致了髓核组织营养物质和氧的匮乏，尤其是腰椎间盘中心［20］，氧分压低而乳酸含量高。因此，耗能少和需要营养物质少的治疗方法也许更适合LDD的治疗。近年来出现的针对特定基因并使其表达沉默的RNAi技术能使处于退化状态的腰椎间盘相关基因表达下调，从而阻止腰椎间盘的退行性变。RNAi技术更注重预防腰椎间盘的退变，理论上讲，还可以逆转腰椎间盘的退变进程［6］。RNAi技术作为一种重要的防治手段已被广泛应用于抑制特异基因的表达及其功能的研究［21］。Kakutani等［22］第一次用人类和大鼠髓核细胞做离体试验，成功地沉默了SD大鼠和脊柱侧凸个体髓核细胞中的靶基因。Seki等［23］通过体外转染及体内注射，利用对解整合素－金属蛋白酶－5(ADAMTS－5)特异的siRNA转染兔髓核细胞，结果显示两种方式都有效地沉默了兔髓核细胞 ADAMTS－5基因。张涛等［24］采用RNAi技术成功地沉默了大鼠腰椎间盘髓核细胞的P53及P21基因，很大程度上改善并延缓了大鼠腰椎间盘组织的退变进程。RNAi技术作为一种新型的防治LDD的基因治疗手段，可以有效地抑制髓核细胞特定基因的表达，还可用以探索特定基因的作用及基因间的相互关系。

5 小结

随着生物技术的发展，基因治疗LDD将会是未来的方向，且当前研究也取得了令人瞩目的成就，但大多研究仍停留于动物实验，真正应用于临床还有许多困难要克服:(1)腰椎间盘是人体内最大的无血管组织，营养物质及氧供应非常有限，尤其是腰椎间盘中心［20］，造成腰椎间盘再生困难。从理论上说，腰椎间盘只能支持少量能耗高的代谢活跃细胞，而促进其再生和刺激细胞外基质合成的方法则不容易成功。(2)LDD的发病机制和腰腿痛机制仍未完全阐明，有待进一步深入研究，进而选择最佳目的基因。 (3)基因治疗的安全性及远期效果也有待于进一步深入研究。期望未来几年基因治疗相关的研究会出现新突破，从而为LDD的基因治疗提供更加安全可靠的方法。

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