VITEK II全自动微生物分析系统应用问题分析

北京军区总医院 检验科，北京 100700

VITEK II全自动微生物分析系统应用问题分析

刘杰，赵满仓，周海峰

北京军区总医院 检验科，北京 100700

本文阐述了 VITEK II全自动微生物鉴定系统的基本结构、工作原理及主要功能，并对其应用中常见问题进行了分析，结合实际提出了相应解决方法。

全自动微生物分析系统；概率百分比；细菌鉴定；药敏试验卡

目前微生物的鉴定技术已逐步由手工走向自动化，法国梅里埃公司生产的VITEK-Ⅱ是当今常用的全自动细菌鉴定系统之一。该系统自动化程度高、软件功能多，检测时特异性高、敏感性强、重复性好，且操作简便、检测速度快，绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内就能得出准确可靠的结果，已被广泛地应用于各大医院和防疫领域。

1 VITEK- II全自动微生物鉴定系统

1.1 基本结构

VITEK II的结构组成：① 装载舱（BOAT）：用于运送载卡架，关闭仪器外门，即可自动完成核对、稀释、填充、切割、封闭及上卡、卸卡等操作；② 充液仓：调整菌悬液浓度，根据不同的细菌选择相应的鉴定卡和药敏试验卡片，将待测菌的菌悬液通过负压充入卡内；③ 封口器：利用高温切割将卡片封口；④ 孵育箱/读取器/退卡装置：卡片在置孵育箱／读数器中孵育，自动定时测试卡内培养基中的生长变化值，读取数据和判断结果；判读结束后，卡片处理仪器自动移除完成测试的卡片，可以降低错误取卡率；⑤ 计算机主机/显示器/键盘/打印机，用于资料的储存和分析、系统的操作、结果的分析鉴定，报告的自动显示和打印；⑥ VITEK II 比浊计：测量待检菌液的McFarland范围，其中GN卡（用于革兰氏阴性菌的测定）和GP卡（用于革兰氏阳性菌的测定）的范围是0.5～0.63，YST卡（用于绝大多数酵母菌及酵母样真菌的测定）的范围是1.8～2.2；⑦ SCS聪明工作站（Smart Carrier Station, SCS）：用于完成资料的初步输入，采用预稀释方式的实验室则较少使用该结构。

1.2 工作原理

VITEK II的生化鉴定根据不同种类微生物的理化性质，以每种细菌的微量生化反应为基础，使用64孔的反应卡片，采用光电比色法，对微生物分解底物导致pH改变而产生的不同颜色进行测定，来判断反应的结果。由计算机控制读数器，每隔1 h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到达临界值，则代表此卡已完成鉴定。最后一次读数后，系统将所得的生物数据与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，经计算后，得出相似系统鉴定值（%Id），即机会率。VITEK II的药敏测定采用64孔卡，每隔15 min用660 nm波长在16个位置各读取3次透光率，与对照孔对比分析，根据生长曲线用动力学法计算最小抑菌浓度（Minimal InhibitoryConcentration, MIC）。同时VITEK II根据细菌耐药规律而设定的专家系统可对结果进行校正和修改。

1.3 概率百分比

在鉴定过程中，软件会将每种细菌或某细菌群的试验反应与预期反应相比较。概率百分比是一个由软件计算的定量数值，表示每种细菌的试验反应与经典反应之间的相关程度。如果某种细菌或细菌群的试验反应模式和经典反应模式完美匹配，概率百分比将达到99%。如果不是完美的匹配，其反应模式仍可能与预期反应模式足够接近，仍可明确鉴定细菌。鉴定可信概率百分比的范围为85%～99%，数值越接近99%，表示该细菌越接近特定细菌的经典模式。若待测菌不能够在2～3种微生物间得到鉴别时，报告会给出一个匹配顺序，表示其试验反应模式与所列经典反应模式之间可能存在的最佳匹配顺序，但此顺序并不表示试验反应与某种可能性的鉴定结果相匹配的模式明显优于另外一种模式。

2 VITEK-II系统的功能

系统可对包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌在内的500余种临床病原菌进行鉴定、药敏等项目的测定。

（1）鉴定：预试验只需要对细菌进行革兰氏染色即可。可快速鉴定定507种细菌（V2S 5.01版）：如GP卡（革兰阳性菌鉴定卡）可鉴定包括葡萄球菌、肠球菌、草绿色和β溶血链球菌、棒状杆菌属以及李斯特氏菌属和丹毒丝菌等在内的116种细菌；GN卡（革兰阴性杆菌鉴定卡）可鉴定包括肠杆菌科、弧菌科和非发酵菌（包括不动杆菌、气单胞菌、产碱杆菌、假单胞菌）等在内的148种细菌；YST卡（酵母菌鉴定卡）可鉴定假丝酵母（念珠菌）、隐球菌、地霉、丝孢酵母、红酵母等在内的50种细菌；ANC卡（厌氧菌-棒状杆菌鉴定卡）可鉴定包括放线菌、拟杆菌、梭杆菌、乳杆菌、真杆菌、梭菌、消化链球菌等在内的63种细菌；BCL卡(革兰氏阳性需氧芽孢杆菌鉴定卡)可鉴定40种芽胞杆菌；NH卡（奈瑟菌-嗜血杆菌鉴定卡）可鉴定包括奈瑟氏菌、嗜血杆菌、金氏菌、摩拉氏菌、布兰汉氏菌等在内的26种细菌；CBC卡（棒状杆菌鉴定卡）可鉴定包括棒状杆菌、乳杆菌及红球菌等在内的64种细菌。

检测卡为一次性消耗品，每张检测卡对应接种1份标本。该系统鉴定大肠埃希氏菌只需4 h就可得出鉴定结果，而传统方法要在24 h后得出结果。且该系统由仪器自动读数、比色、处理数据、打印结果，避免了人工判断误差。

（2）药敏测定：分AST-GN革兰阴性杆菌药敏卡、AST-GP革兰阳性球菌药敏卡、AST-ST链球菌药敏卡、AST-YS酵母菌药敏卡以及多种药物组合的药敏卡，可同时进行20种抗生素的药敏试验。

（3）高级专家系统（AES）功能：将不同专家的知识、经验汇集在一起编写成的计算机软件，是建立在MIC基础上，综合了微生物、药理、临床等多学科知识，具备CLSI（美国）和CASFM(欧洲)两种判读指南的多能专家系统，其对测试结果的审核能够确保结果的准确性。该系统主要功能有：① 能确认鉴定及药敏结果的准确性；② 可检出每菌株拥有的1种或多种耐药表型；③ 可根据耐药表型提示200种耐药机理，2000种耐药表型，及20000个MIC分布图；④ 可根据CLSI或其他指南或权威文献对药敏结果提出修改建议；⑤ 可推测没有测试的抗生素药敏结果；⑥ 在病人报告中依照临床特点提出有针对性的用药指引。

3 VITEK-II结果说明

3.1 鉴定结果

（1）一般仅给出单一结果，无需进行补充试验，电脑主机VITEK 2 程序浏览结果时，可见结果可信度评估。单一良好结果可直接传输到病人资料数据库（LSN）和中文软件中（在打开demoless模式设置并保证中文软件通讯端口打开情况下），并可长期储存。

（2）给出两个及两个以上结果，如某些细菌菌种可能会出现相似细菌的（混合）分类群鉴定结果，当所列分类群的生化谱相同时会出现这种情况。仪器会提示进行补充试验以区分相似细菌的分类群，可判定相似细菌或低分辨率鉴定结果，选择正确的鉴定结果，并将结果传输到LSN中。

（3）不能鉴定或无法确定的结果，提示查找原始分离平板，确认所分离细菌是否为纯培养，必要时重新分离细菌并重新进行鉴定试验。如果某特定鉴定模式是未被认可的模式，会列出一个可能细菌的列表，否则就会确定菌株不在数据库范围内。

注意某些分类群的相关注释，如白喉棒状杆菌是重要的病原体，鉴定结果可能对病人或标本有临床意义且结果需要审核。

3.2 药敏结果

（1）如果同时进行鉴定和药敏试验，细菌鉴定结果会自动加到药敏卡上；否则需手工添加细菌名称到药敏卡上。

（2）如果有专家系统评语出现，则应按操作规程对药敏结果作适当的修改并确认最终结果。

（3）如果有浏览信息出现，应按程序处理浏览信息并确认最终结果。

（4）上述步骤处理完毕，结果会自动传输到LSN数据库中。

（5）对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定，如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌、对泰能耐药的肠杆菌、对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。

4 常见的问题及对策

4.1 没有充分生长

（1）阴性结果（生化谱）的情况：① 如果两次读数的间隔时间相差40 min以上，报告“卡片错误-丢失数据”；② 提示“细菌的生化谱反应性低-请确认是否为活菌”，可用无菌注射器从生长对照孔或葡萄糖反应孔吸出样品0.1 mL接种血琼脂于5%～10% CO2中于35 ℃培养18～24 h，判定是否为活菌；③ 如果某未知细菌的卡片结果是完全阴性或低反应性，计算生化谱时结果将显示为“无反应或低反应生化谱”。如出现以上问题只有重新进行试验。

（2）卡片填充不当：上机前，菌株的革兰氏染色必须准确，否则可能上错卡。其他的前处理，包括凝固酶、触酶、氧化酶等的手工操作要规范，保证附加试剂不过期，才能正确判断阴阳性，保证仪器正确选择卡片。同时还要注意各种卡片本身是否合格、是否过期等。如出现该类问题只有重新进行试验。

4.2 不能鉴定细菌

（1）待检菌不是单一菌株。首先每株细菌标本都要进行纯培养后方可进行鉴定；其次是操作过程中的污染，如混悬液(稀释用盐水）、吸头、加样枪等的污染会造成菌液不纯。必须经常更换稀释用盐水，每周把稀释用加样器用高压锅消毒一次（121 ℃，15 min）。

（2）反应卡充液不完全。在配菌悬液时量要加足，才能排除悬液吸空时引入气泡造成部分小孔未充入菌液，而产生假阴性结果。

（3）菌液浓度不准确，菌液浓度太淡或太浓。基本是由于比浊仪长时间未进行校准，造成浊度不准。必须经常用标准管校准仪器，同时在比浊时，要先调零，才能保证浊度的准确性。

（4）菌龄不在对数生长期。一般纯培养的菌株，18～24 h为最佳，质控菌要反复传代2～3次才能上卡片，尽量使菌群位于对数生长期。

（5）菌悬液不易乳化。像一些链球菌和棒状杆菌，由于在盐水中不易乳化，造成细菌分布不均匀，使得仪器不能对其鉴定。可在配制悬液时，加大浊度，再进行鉴定。

（6）数据库缺乏罕见生物新种或不典型菌株的资料。如假结核棒状杆菌、麦氏棒状杆菌、产粘棒状杆菌、杰氏棒状杆菌、密歇根棍状杆菌等细菌，其试验结果位于非典型或处于未鉴定区域，这是因为数据库缺乏相关资料造成的。可通过传统分类法，参照双歧检索表，对菌株进行鉴定；也可选择其他鉴定方法，如VITEK-MS；还可参照其他公司鉴定仪的细菌数据库进行鉴定。

（7）光学系统未校正。读数仪光学读数头出现问题，需要定期校准。

4.3 鉴定评论信息

在结果中有时会出现如“好的可信性但难于区分”(Good Confidence，Marginal Separation)的鉴定评论信息，即生化反应结果同时相似于数据库中两种菌群，且产生可接受的绝对相似值，需加做一些试验方可确定其鉴定结果。

5 讨论

1970年，法国梅里埃推出API微生物鉴定条，API彻底改革了细菌学领域。传统的微生物鉴定方法至今仍存在操作复杂，不易判读的缺点。API使得细菌的鉴定变得快速和可靠。全球微生物学家均在使用简单而高性能的API系统，使之迅速成为细菌鉴定的国际金标准。API/ID 32是目前涵盖范围最广的细菌鉴定系列，包括15种鉴定系统，涵盖了微生物实验室可能会遇到的所有细菌种属如葡萄球菌（API Staph）、肠杆菌科（API 20E）、非发酵革兰氏阴性杆菌（API 20NE）等。但是API毕竟是个手工系统，因此梅里埃公司有研发了VITEK 系列全自动微生物鉴测仪[1-3]。

VITEK II[4-5]及其同系列VITEK 2 COMPACT[6]鉴定仪是目前在微生物检验中使用率较高的全自动微生物鉴测仪。VITEK II鉴定法与传统鉴定法相比，具有功能多、速度快、中间环节少、结果准确、自动化程度高等优点。但VITEK II鉴定法也有它的局限性，如VITEK-Ⅱ数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性。迄今为止，尚无一个鉴定系统能涵盖所有的细菌鉴定资料，因此微生物的鉴定也仍以传统的手工鉴定方法API为“金标准” 。

在日常工作中，要得到正确的鉴定结果，技术人员的素质和经验很重要，应对技术人员进行手工鉴定基础与操作技能培训，如革兰氏染色,形态学的观察、填卡前的预处理等。此外，随着人们对细菌本质认识的加深，细菌的分类系统不断演变，应及时按照CLSI新标准对数据库进行更新。总之，不断提高操作人员的操作能力与综合素质，及时更新仪器数据库，遇到问题及时与厂家联系，才能不断提高临床微生物鉴定和药敏结果的准确性[7]。

[1] 郭民,孟伟．VITEK微生物分析系统的应用研究[J]．中国微生态学杂志,2007,19(2):226-228．

[2] 黄训端,潘见,余晓峰,等．草莓中蜡样芽孢杆菌的VITEK快速检测[J]．微生物学杂志,2006,26(4):99-102．

[3] 毛彩萍,周国明．两种仪器在微生物室间质评中的应用与比较[J]．中华医院感染学杂志,2006,16(10):1195-119．

[4] 段纯,朱岩,李素丽,等．儿童患者血培养分离人苍白杆菌耐药性分析[J]．中华医院感染学杂志,2011,21(3):606-607．

[5] 林晓梅,周铁丽,李超．副流感嗜血杆菌生物分型与方法评价[J]．江西医学检验,2002,20(2):87-88．

[6] 乔宁,喻华,殷琳,等．VITEK 2 COMPACT全自动微生物分析仪性能分析[J]． 淮海医药,2012,30(3):211-213．

[7] 冯念伦,孙铁军,刘文兰．全自动微生物鉴定和药敏分析仪器的解析及应用[J]．医疗设备信息,2006,21(11):91-93．

Analysis of Application Problems of VITEK II Automatic Microbe Identification System

LIU Jie, ZHAO Man-cang, ZHOU Hai-feng
Department of Laboratory, General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China

This paper discussed the basic structures, working principles and main functions of VITEK II automatic microbe identification system, and analyzed the common application problems of the system to find the corresponding solutions based on practices.

automatic microbe identification system; percentage probability; bacteria identification; test cards of drug susceptibility

TH776

B

10.3969/j.issn.1674-1633.2013.09.045

1674-1633(2013)09-0119-03

2013-03-25

作者邮箱：fhalj1@yahoo．cn