人脐静脉内皮细胞在糖尿病血管并发症研究中的应用进展

杨 芳 李强翔 (南华大学附属娄底市中心医院，湖南 娄底 47000)

人脐静脉内皮细胞(HUVECs)是一种干细胞，一般取自健康正常分娩或剖宫产孕妇的脐静脉，再用胰酶消化法分离培养。因为其能无限次传代(理论上)，易于实验操作，近年来经常用于各种糖尿病血管并发症实验的研究。

1 糖尿病血管内皮细胞损伤的发生机制

1.1 高糖引起HUVECs损伤中的发生机制

1.1.1 高浓度葡萄糖对HUVECs活力和黏附分子表达的影响研究发现〔1〕，用高浓度葡萄糖培养HUVECs，其白细胞黏附分子的表达可增加，并可诱导内皮细胞和单核细胞黏附。且蛋白激酶C途径是高糖诱导的血管细胞黏附分子(VCAM-1)、细胞间黏附分子(ICAM-1)表达增加最直接有效的途径。所以抑制以上途径有可能减少动脉粥样硬化的发生。我们可以认为，如果使用新的或现有的治疗糖尿病的药物降低血糖的同时并可减少ICAM-1、VCAM-1表达增加的药物，也许对减少糖尿病患者慢性并发症的发生率是条有益的途径〔2〕。

1.1.2 高糖对HUVECs血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响 VEGF又称为血管通透性因子。目前已知的，视网膜的全层和肾脏的大部分组织分布有血管内皮生长因子及其受体。研究发现，VEGF在高糖条件下可通过作用于视网膜血管内皮细胞上的大量高亲和力受体，来促进血管内皮细分裂和增殖，并可导致视网膜新生血管形成。另有学者认为，VEGF的表达可能参与糖尿病一视网膜屏障的破坏。且有实验数据显示〔3〕，人脐静脉内皮细胞VEGF mRNA的表达可伴随高糖浓度的增加而逐渐增加，在22 mmol/L达到最高峰，从44 mmol/L时下降;且在22 mmol/L葡萄糖的持续作用下，随着作用时间的延长，VEGF水平逐渐升高;而当作用72 h时VEGF mRNA水平却不再增加。因此，研究表明〔4〕，高血糖其本身可引起 HUVECs的VEGF mRNA表达的增加，并且在一定范围内呈时间和剂量依赖性。

1.1.3 高糖对HUVECs凋亡的影响 内皮细胞凋亡是糖尿病患者血管并发症发生的始发因素〔5〕。

1.1.3.1 eNOS表达减弱可以增加内皮细胞凋亡的发生 体外实验研究发现，在高糖的影响下，可促使线粒体呼吸链中氧自由基生成增加，并使舒血管物质一氧化氮(NO)利用率下降，核因子-κB(NF-κB)活性降低，和缩血管物质内皮素的生成增多，引起内皮依赖的血管舒张功能缺陷，继而导致糖尿病患者微血管和大血管并发症的发生。且研究观察到，用高浓度葡萄糖和甘露醇分别诱导HUVEC内皮微粒(EMPs)的释放，前者其EMPs的释放水平与细胞凋亡率呈正相关;而后者与细胞凋亡率则无显著性差异。该结果提示，细胞内皮微粒的释放水平的改变与高糖本身或其反应产物有关，其更进一步导致细胞损伤。在高糖影响下，HUVEC的凋亡以及功能障碍与许多因素有关，调节机制比较复杂。而内皮细胞的功能状态决定其释放的EMPs的水平与性质。因此，EMPs在今后心血管领域等方面的研究主要集中在其促凝、促炎反应，及其加重内皮功能障碍和促进血管生成的作用〔6〕。血管内皮细胞(EC)的凋亡是糖尿病大血管病变的最初的启动因素，一系列血管结构和功能的改变都与之有关，并且最终可引起动脉硬化〔7〕。血管内皮结构的损害及其在调控血管张力、血管通透性、血流、凝血及血栓溶解上的作用的削弱均与内皮细胞凋亡增加有关，并且最终可诱发血管病变的发生。内皮型一氧化碳合酶(eNOS)是血管内皮细胞产生NO的主要限速酶。一般情况下，内皮细胞释放的NO可以起到重要的血管保护作用。研究已经证实HUVEC表达eNOS的改变与C肽有关。且进一步发现，高糖可以引起eNOS的表达减弱，且与细胞凋亡呈负相关。即eNOS表达减弱可以增加内皮细胞凋亡的发生，提示可通过调节eNOS途径，抑制细胞凋亡，来发挥糖尿病的血管保护作用〔8〕。

1.1.3.2 Wnt信号通路抑制和抑制FKN蛋白表达上调可导致内皮细胞凋亡 有研究〔9〕探讨高糖诱导的HUVECs的CX3C类趋化因子fractalkine(FKN)表达与细胞凋亡的可能机制。用对数生长期的HUVECs，分为正常组(N)、高糖组(HG)、氯化锂(LiCl)组、高糖+LiCl组(HG+LiCl)。用低糖(如5.5 mmol/L)DMEM培养的HUVECs种板10 h后按以上分组分别加入10 mmol/L的LiCl预处理2 h，再用高糖(如33.3 mmol/L)干预48 h，用免疫组化 SABC法检测 β-catenin及 p-GSK-3β(Ser9)，TUNEL法检测细胞凋亡，免疫荧光FITC法检测FKN蛋白水平变化，RT-PCR检测GSK-3β和FKN mRNA水平变化。结果显示:①与正常组比较，高糖诱导的HUVECs凋亡率明显增加。与高糖组比较，LiCl可明显降低高糖环境下HUVECs的凋亡率，但仍高于正常组。②与正常组比较，高糖组HUVECs的多功能的蛋白质β-catenin及磷酸化糖原合成酶激酶 p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达降低;GSK-3βmRNA水平及FKN蛋白和mRNA水平升高。③与高糖组比较，LiCl+高糖组HUVECsβ-catenin及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达升高，GSK-3βmRNA水平及 FKN蛋白和mRNA水平降低。因此，Wnt信号通路的激活是由于激动剂LiCl通过抑制GSK-3β活性等一系列级联反应促进βcatenin入核而激活下游转录因子来起作用的。该研究揭示了高糖可诱导趋化因子FKN表达且能被LiCl部分抑制，是其抑制HUVECs的经典 Wnt信号通路，并发现，高糖诱导的 HUVECs凋亡也可被LiCl部分抑制，提示高糖诱导的FKN表达和HUVECs凋亡可能与Wnt信号通路有关。由此，在以后糖尿病的治疗中我们可以着重研究适当激活Wnt信号通路或者抑制FKN表达而降低血管ECs凋亡和抑制炎症反应方面的作用。

1.1.3.3 球状脂联素抑制波动性高血糖诱导HUVECs凋亡有实验〔10〕探讨球状脂联素在抑制波动性高血糖诱导HUVECs凋亡中的机制。在不同条件下体外培养HUVECs 5 d。实验分为对照组、高糖组、葡萄糖交替组(每8 h更换培养液一次)、高渗组(甘露醇)和高渗交替组。葡萄糖交替组中部分细胞用不同浓度球状脂联素干预，用脂联素受体1特异性小干扰RNA作用内皮细胞。采用流式细胞仪检测细胞凋亡及RT-PCR检测脂联素受体1和受体2的mRNA表达。结果与对照组比较，高糖组和葡萄糖交替组细胞凋亡明显增加，脂联素受体1 mRNA的表达显著降低。与高糖组比较，葡萄糖交替组细胞凋亡显著增加，脂联素受体1 mRNA的表达显著降低。不同浓度球状脂联素作用内皮细胞，发现3 mg/L球状脂联素能显著抑制内皮细胞凋亡，并能显著拮抗波动性高血糖诱导的脂联素受体1 mRNA表达的下降。不同组间内皮细胞脂联素受体2 mRNA表达差异无显著性。siRNA作用内皮细胞后球状脂联素这种抑制凋亡作用显著减弱。结果示:与持续性高血糖条件比较，波动性高血糖显著降低HUVECs脂联素受体1 mRNA的表达，而对脂联素受体2 mRNA的表达无影响。因此，球状脂联素可能通过脂联素受体1拮抗波动性高血糖诱导的HUVECs凋亡。

1.1.3.4 高糖对HUVEC的c-Jun基因表达的影响 c-Jun基因是细胞内的一种原癌基因，其表达产物Jun与Fos形成异源二聚体，即有活性的转录因子AP-1，可以通过对靶基因调节，参与多种细胞增殖、凋亡的过程。有实验〔11〕将HUVEC体外培养至第3代，然后分别用不同浓度葡萄糖培养液培养HUVEC，并将高渗甘露醇培养液培养者设为对照组。以一定浓度葡萄糖(如22.0 mmol/L)分别作用不同时间，应用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测c-Jun mRNA和蛋白表达水平。结果显示，高糖以浓度依赖方式上调HUVEC的c-Jun mRNA的表达，高浓度葡萄糖达到最强刺激效应，与低浓度葡萄糖组及对照组比较差异均有统计学意义。其中22.0 mmol/L葡萄糖刺激0.5 h c-Jun的mRNA表达升高，刺激1.0 h达高峰，2.0 h开始下降。22.0 mmol/L葡萄糖刺激2 h后，人脐静脉内皮c-Jun蛋白表达增加。因此，高糖可上调HUVECs c-Jun mRNA和蛋白表达。

总之，HUVECs凋亡的基因表达和调节机制非常复杂，高糖对其的影响因素也很多，其细胞生物学机制还有待于我们继续探讨和研究。

1.2 2型糖尿病患者低密度脂蛋白对HUVECs损伤 糖尿病的高血糖状态是由于氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)引起的潜在的氧化损伤以及氧化应激的增加引起的。当低密度脂蛋白(LDL)颗粒在血管壁处吸收并氧化，可以促进泡沫细胞的形成，遏制eNOS的产生，从而最终导致动脉粥样硬化(AS)的形成。2型糖尿病患者的AS发生率明显比正常人高，其血管并发症的启动因素可能与血管内皮功能下降有关。NO是血管内皮细胞生成的多种生物活性因子中主要的舒血管物质。内皮功能障碍主要表现为NO的生理活性下降〔12〕，且AS发生发展中一个重要的因素是NO生理活性的下降。许多研究发现〔13〕，AS的形成与LDL的氧化修饰有关。有研究〔14〕将正常人LDL(nLDL)、糖尿病患者LDL(dLDL)、人工氧化的LDL(ox.LDL)分为三组，并以人工氧化的LDL作为损伤阳性对照，分别与内皮细胞孵育一段时间后，观察上清液中NO与丙二醛的变化，来探讨dLDL损伤内皮细胞的机制，尤其是对时间效应的影响，研究2型糖尿病血管并发症的发生发展的过程，为2型糖尿病患者的临床治疗及康复干预提供了重要的理论依据。

1.3 游离脂肪酸对HUVECs的影响和作用 有研究发现〔15〕，游离脂肪酸(FFA)可引起静脉内皮细胞(VEC)功能损伤。此研究是用生理浓度的软脂酸培养HUVEC，观察到随着时间的延长，细胞死亡数逐渐增加。且有研究〔16〕在相同条件下，观察了葡萄糖对HUVEC的细胞生存状况的影响，发现HUVEC在较高浓度的葡萄糖状态下，且当作用时间延长时，细胞仍未出现明显的毒害作用或死亡。结果提示软脂酸对VEC有较强的毒性作用;而葡萄糖对HUVEC的毒性作用远远小于FFA，或者说葡萄糖对HUVEC的损伤作用可能在功能水平而不是在细胞的生存水平;同时推测葡萄糖对HUVEC的毒性作用是一个长期的、慢性的过程，短时间内并不能反映其伤害作用和程度。并且将葡萄糖与软脂酸共同作用于细胞时，细胞死亡数目较软脂酸单独作用时增多，其细胞死亡率随着葡萄糖浓度的增加而增加，提示软脂酸对HUVEC的毒性作用在高糖状况下可加重。我们可以由此推测:当软脂酸和葡萄糖共同培养细胞时，细胞死亡率增加可能是因为葡萄糖虽然没有引起细胞死亡但可造成细胞功能损伤，而有功能缺陷的细胞在软脂酸的毒性作用下，细胞死亡加速，其损伤程度大大增加。因此在临床上我们看到很多糖尿病患者伴有高FFA血症时比单纯的高FFA血症的患者相对其大血管并发症的发生率要高得多。而将高浓度的胰岛素与软脂酸两者共同作用于细胞或将胰岛素、葡萄糖和软脂酸三者共同作用于细胞时，发活率比软脂酸单独作用组明显增加，而细胞的死亡率较葡萄糖与软脂酸共同作用时明显减少，进一步提示胰岛素本身对HUVEC不但没有毒性作用，反而还有保护作用。在实验中用流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果显示，生理浓度的软脂酸短时间内作用于细胞时，细胞就表现为凋亡，再延长作用时间或加大软脂酸浓度时，细胞表现为死亡;而高浓度葡萄糖作用于HUVEC较长一段时间后，细胞方出现凋亡，延长作用时间时只是细胞的凋亡数增多。说明葡萄糖、软脂酸对HUVEC造成的损伤其程度和机理并不相同，由此可推测，FFA毒性比葡萄糖大，短时间内就可引起细胞的DNA严重损伤而死亡，而葡萄糖只是扰乱了DNA的功能，故对细胞的损害只是表现为凋亡。所以，研究结果〔17〕表明FFA和葡萄糖均可引起HUVEC损伤，但FFA比葡萄糖对HUVEC的毒性作用远远要大，FFA可直接损伤细胞，且高糖状况下会加重FFA对HUVEC的损伤，胰岛素本身对HUVEC有保护作用，HUVEC的损伤并不是高浓度的胰岛素引起的;葡萄糖对HUVEC的损伤机制主要是引起细胞凋亡为主，而FFA是以引起细胞死亡为主。

2 某些抗氧化剂对糖尿病引起的HUVEC损伤的保护作用

人体内许多的生物化学反应与高血糖有关，在高糖状况下氧自由基(OFR)产生增加，所以，糖尿病时患者氧化应激增加，抗氧化剂可以减轻细胞脂质过氧化，不但能够减轻高血糖对血管内皮细胞的损害，而且还可以保护血管内皮细胞〔18〕。

2.1 N-乙酰半胱氨酸对波动性糖环境下脐静脉内皮细胞损伤的保护作用 N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一种抗氧化剂，可以减少体内自由基生成和清除细胞已生成的自由基。实验证实，NAC是通过抑制内皮细胞的脂质过氧化反应，来降低引起内皮细胞损伤的过氧化脂质(LPO)的含量的。其可能是通过阻断OFR连锁反应，避免生物膜磷脂中的不饱和脂肪酸受氧化，保护细胞膜上蛋白质的空间构型不受改变，来减少内皮细胞内大量LPO的生成和蓄积，从而阻止了不饱和脂肪酸过氧化对的膜结构和功能的损伤，维护细胞的稳定。有文献报道〔19〕，高糖状况会抑制血管内皮细胞的增殖，其增殖指数下降。在细胞增殖过程中存在多个监控系统，当其探测到损伤时，就会终止细胞增殖进展，使细胞周期停留在周期进程中的2个限制点，G/S或G/M转变期。本研究示，在高糖或波动性糖影响下，使细胞被阻滞于G/S转变期，细胞增殖受抑制;若实验前加入NAC，则S期细胞增殖的百分率显著升高，G期细胞增殖的百分率降低，提示高糖及波动性糖对内皮细胞增殖的抑制作用能被NAC减轻。综上，NAC可降低细胞内脂质过氧化作用，发挥对过氧化脂质所致血管内皮细胞损伤的保护作用。因此，我们以后在动脉粥样硬化及糖尿病等疾病所伴随的血管内皮功能失调方面的防治方面可以重点研究NAC在血管内皮上所具有的抗氧化活性作用〔20〕。

2.2 中药大黄素对糖尿病血管内皮损伤的保护作用 大黄素是一种羟基蒽醌的衍生物，主要从大黄的根茎等中药中提取获得。大黄素在清除自由基、抗纤维化、抑菌、抗炎、抗肿瘤等方面具有显著的作用〔21～24〕。早有报道〔25〕证实，在 NF-κB 信号转导途径中干扰素α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞中黏附分子VCAM-1，ICAM-1和E-selectin的表达的抑制与大黄素有关。Li等研究也发现大黄素对体外脂多糖(lipopolysac charide，LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应具有明显的抑制作用，其可以抑制白血病介素IL-10及TNF-α的表达，以及NF-κB的活化。为了研究大黄素在血管内皮方面的抗血管炎症反应的作用，有实验〔26〕以LPS诱导的HUVECs炎性反应为研究模型，用大黄素与血管内皮细胞共同培养后，发现LPS诱导的内皮细胞中NF-κB的活化和IκB的降解均减少，提示大黄素能够通过抑制以上反应来抑制内皮细胞中促炎因子IL-1β和趋化因子的表达。但是大黄素没有对IL-1β诱导的血管内细胞中NF-κB的活化和IκB的降解产生抑制作用，说明大黄素的作用靶点可能位于LPS受体复合物部位，而不是位于LPS和IL-1β所共同的信号转导途径中。综上，大黄素抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎性反应的活性提示，其可能在防治动脉粥样硬化或与炎症相关的心血管疾病方面具有应用前景。

综上所述，内皮细胞损伤是糖尿病血管病变的最初的启动因素和基础，早日阐明血管早期损伤的机制有助于推迟或阻止糖尿病血管损伤的发展，这对明确糖尿病血管并发症的确切机制有着重要意义。

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