五味子总木脂素与顺铂抑制大鼠胶质瘤细胞增殖的作用

金 宏 信 宏 于洪泉 温 娜 唐泽波 齐 玲 刘兴吉 (吉林医药学院，吉林 吉林 303)

五味子总木脂素是中药材五味子中的重要组成成分。近年研究表明，五味子总木脂素具有很强的生物学活性，具有抗肿瘤〔1〕、保护肝脏和抗氧化作用、抗病毒作用、对中枢神经系统的抗抑制和抑制作用，以及抑制平滑肌收缩和增强免疫功能、促进蛋白质合成、促进糖原合成等多种作用〔2〕。但该药物通过何种方式发挥其各种作用目前尚不明确。本实验旨在研究五味子总木脂素作用于大鼠C6脑胶质瘤细胞后发生的效应，以及该药协同常规化疗药物顺铂作用后细胞的反应，为该药早日应用于临床奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 细胞培养基RPMI-1640(Thermo公司)、小牛血清、0.25%胰酶(美国Gibco公司);顺铂(阿拉丁公司，中国)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，Thermo公司)。

1.2 细胞培养 将配制好的RPMI-1640培养基置于培养箱中预热，自-80℃冰箱中取出大鼠脑胶质瘤C6细胞，迅速置于37℃水浴至融化，离心后小心吸出上清，将细胞用1 ml培养基混匀放入培养皿中，再加入9 ml新鲜培养基，轻轻混匀后放入5%CO2、37℃培养箱中进行培养。倒置显微镜下观察细胞生长良好，待80% ～90%融合时进行传代。

1.3 MTT法检测五味子总木脂素对大鼠胶质瘤细胞的作用将五味子总木脂素用含5%小牛血清RPMI-1640细胞培养液溶解后，配制成终浓度为 0、50、100、200 μg/ml的药物。取对数生长期的脑胶质瘤C6细胞，用胰酶消化后，用含5%小牛血清RPMI-1640细胞培养液调整细胞浓度为8×103/ml。将细胞悬液均匀接种于96孔板中，每孔100 μl，置入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，使细胞同步化。弃去上清液，加入含不同浓度的五味子总木脂素，每个药物浓度重复5次。药物作用结束时，每孔加入 MTT 20 μl，37℃ 继续孵育 4 h，弃上清液，每孔加DMSO 150 μl，振荡均匀使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，用不加细胞的空白孔调零。

1.4 MTT法检测五味子总木脂素联合顺铂对胶质瘤细胞的作用 将细胞以8×103个/孔接种于96孔板培养24 h后，将细胞分为四组，分别为五味子总木脂素组(200 μg/ml)，顺铂组(10 μg/ml)，联合用药组(五味子总木脂素 200 μg/ml+顺铂10 μg/ml)，对照组使用基础培养基。余下步骤同1.3。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，实验结果以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD、DUNCAN法和t检验。

2 结果

2.1 大鼠胶质瘤细胞株C6细胞的培养 大鼠胶质瘤C6细胞经复苏后培养，细胞在复苏2 h开始贴壁，初期呈圆球形，随着时间的延长，细胞逐渐出现突起，开始呈现长梭形，24 h后90%以上的细胞都已贴壁，大部分可见明显的突起。

2.2 大鼠胶质瘤C6细胞对五味子总木脂素的敏感性 大鼠胶质瘤细胞在药物低浓度(0.50 μg/ml)时无明显的抑制效应发生，OD值分别为0.69±0.03、0.78±0.03，甚至出现轻微的增殖现象，药物浓度达到100 μg/ml时促进增殖作用明显(0.83±0.03)(P ＜0.01)，但当药物浓度达到200 μg/ml时，细胞开始出现明显的生长抑制(0.53±0.03)(P＜0.01)，说明五味子总木脂素在低浓度时可以促进细胞增殖，而药物浓度达到200 μg/ml时，抑制细胞生长。

2.3 五味子总木脂素联合顺铂对胶质瘤细胞的作用 大鼠C6胶质瘤细胞经五味子总木脂素作用后，其OD值为0.53±0.03，顺铂组OD值为0.64±0.03，木脂素与顺铂联合组为0.43±0.01，与对照组(0.75±0.04)相比，具有显著性差异(P＜0.01)，而且两药联合应用效果更为显著，说明五味子总木脂素与顺铂联合应用在治疗胶质瘤方面具有协同作用。

3 讨论

脑胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，发病率约为40.49%，综合发病年龄高峰在30～40岁或10～20岁。世界卫生组织公布按死亡率顺序排位，恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～54岁患者的第3位死亡原因。胶质瘤系浸润性生长物，它和正常脑组织没有明显界限，难以完全切除，对放疗、化疗不甚敏感，非常容易复发。化学药物和一般抗肿瘤的中药，因血脑屏障等因素的影响，疗效也不理想。因此，脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。

研究表明，中药五味子具有毒性低〔3〕和明确的抗肿瘤作用〔4～6〕。本研究发现，五味子总木脂素在低浓度时对胶质瘤细胞无明显的抑制作用，甚至出现轻微的增殖现象，当药物浓度增加到200 μg/ml时，细胞生长出现明显的抑制，这一结果与之前的研究结果一致〔7〕。提示高浓度五味子总木脂素可以有效抑制肿瘤细胞增殖。

顺铂是传统的抗肿瘤药物，但是临床用药表明，大剂量应用顺铂时其毒副作用较明显，人体难以耐受，导致部分患者难以达到理想的治疗效果。本课题组发现，五味子总木脂素联合顺铂能更加有效地抑制肿瘤细胞增殖，具有极强的杀伤胶质瘤细胞的能力。这一结论与吕冬霞等〔8〕研究结果一致。本实验有力地证实了五味子总木脂素与顺铂可发生协同作用，两药联合应用可以加强药物的抑瘤作用，但两个药物发生协同作用的机制目前还不明确，联合用药后是否可以减少顺铂用量，在降低毒副作用的同时达到最好的治疗效果，这些都有待于进一步研究。

1 Chiu PY，Lam PY，Yan CW，et al.Schisandrin B protects against solar irradiation-induced oxidative injury in BJ human fibroblasts〔J〕.Fitoterapia，2011;82(4):682-91.

2 吴立军.天然药物化学〔M〕.第5版.北京:人民卫生出版社，2009:5.

3 苗明三.五味子多糖对衰老模型小鼠的影响〔J〕.中国医药学报，2002;17(3):187-8.

4 李先伟，杨解人.五味子乙素抗H2O2诱导PC12细胞凋亡的机制〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(12):2244-7.

5 任丽佳，李 林，殷放宙，等.五味子抗肿瘤活性成分及作用机制研究进展〔J〕.中国药理学通报，2012;28(1):140-2.

6 牟遇霖.五味子抗肿瘤的研究现状〔J〕.中国医药导报，2010;7(2):84-5.

7 金 宏，温 娜，纪鹏艳，等.不同浓度五味子乙素对脑胶质瘤SHG-44细胞增殖的影响〔J〕.中国实验诊断学，2011;15(12):2026-7.

8 吕冬霞，崔 健，刘月霞，等.五味子乙素联合顺铂对H22荷瘤小鼠存活时间的影响〔J〕.黑龙江医药科学，2008;31(5):9-10.