转基因常见检测技术与蛋白质组学的应用

方献平，马华升，余 红，金 亮，刘 辉，张 乐，翁丽萍，来文国

(1.浙江省杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024;2.浙江大学，浙江杭州 310058)

自1996年转基因作物商业化种植以来，在全球发展迅猛，产生了巨大的经济效益。根据农业生物技术应用国际服务组织 (ISAAA)2007年度报告，转基因作物种植面积从1996年的170万hm2到2007年的1.143亿hm2，增长了60倍。转基因作物种植的国家达到23个，另有29个国家同意转基因作物作为食品和饲料进口，或进行环境释放试验。目前共有23种转基因作物的1 247个项目获得615项批准。2006年全球转基因作物种植者的净收益是70亿美元，1996－2006年间的累计收益达340亿美元。在我国，目前批准商业化种植的转基因作物有抗虫棉、延迟成熟番茄、抗病毒番茄、抗病毒甜椒和线椒、改变花色的矮牵牛以及抗病毒木瓜等，其中抗虫棉的种植面积最大。2006年我国转基因作物种植面积达350万hm2，是转基因作物种植第6大国。

然而转基因生物在给人类带来诸多好处的同时，其安全性问题一直备受争议。1998年，英国Rowentt研究所的Pusztai博士在电视台发表讲话，声称大鼠食用转雪花莲凝集素基因的马铃薯后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到破坏。此后，又相继发生了斑碟事件、加拿大超级杂草事件、墨西哥玉米事件、中国Bt抗虫棉事件、转基因大豆中多余未知的DNA等一系列重大的转基因事件，引发了国际社会对转基因作物及其产品对人类健康和生态环境影响的激烈争论和广泛关注。尽管后来的调查证明，这些事件中所得结论缺乏科学依据，而且目前批准商业化的转基因作物及其产品尚未发现有安全性问题，但转基因作物的应用毕竟只有短短的10多年，其潜在的风险和非预期效应难免让人担忧。

为了加强对转基因作物的管理，世界各国纷纷制定了相应的法律法规。1998年6月欧盟规定，对农作物的种子、食品和饲料贴示标签，必须标示其是否含有转基因成分;随后又规定，当转基因成分超过1%时，实行强制性标识制度;2002年欧盟执行新的转基因产品管理法规，要求对转基因产品从生产、运输、保存、销售进行全程的跟踪、检测。到目前为止，已有包括欧盟国家在内的40多个国家和地区制定了相关的法律和法规，要求对转基因生物及其产品 (包括食品和饲料)进行标识管理。在我国，2001年5月国务院颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，将研究试验、生产、加工、经营和进出口各环节都纳入了农业转基因生物安全管理的范畴。2002年以来，农业部先后发布了与之配套的4个管理办法，即《农业转基因生物安全评价管理办法》《农业转基因生物进口安全管理办法》《农业转基因生物标识管理办法》和《农业转基因生物加工审批办法》。这些法律、法规的实施标志着中国农业转基因生物安全管理进入法制化、规范化的管理轨道。在我国境内从事农业转基因生物的研究、试验、生产、加工、经营和进口、出口活动都须遵守这些条例，这是符合国际惯例，是非常必要的。在杭州市，农业部也专门批准设立了农业部农产品及转基因产品质量安全监督检验测试杭州分中心。

转基因生物安全问题需要进行转基因生物安全评价，而转基因生物检测技术是安全评价的关键之一。因此，研究转基因农产品检测的关键技术，探索转基因生物计量和全程溯源技术，建立转基因农产品安全检测技术体系，成为亟待解决的关键问题。本文针对目前常用的转基因安全检测技术及蛋白质组学技术在转基因作物检测中的应用前景进行综述。

1 转基因检测的常用方法

目前国际社会对转基因食品的检测技术主要有两类，即检测转基因成分核酸序列和检测转基因成分编码的蛋白质。

1.1 基于核酸的检测方法

针对外源目的DNA的检测技术主要有3种。

1.1.1 分子杂交技术

利用 Southern Blot法，不仅能够检测外源DNA，而且能够确定外源基因在植物基因组中的排列情况和拷贝数等;但Southern blot是将目的DNA进行原位杂交，没有扩增、放大的过程，所以检测的灵敏度要比PCR检测方法低得多。

1.1.2 PCR方法

包括定性PCR方法、复合PCR方法、竞争性定量PCR方法和荧光定量PCR方法。转基因产品PCR检测方法的主要依据是特异性扩增外源基因片段，对于同一待测样品，选择不同的特异性目的基因片段得到的PCR检测结果可能不太一致。因此建立转基因产品PCR检测方法时，需充分考虑特异性扩增的目的片段。PCR引物的设计和反应条件的优化、如何处理每对引物反应效率不一致性、检测通量不高等都是检测中需要解决的问题。

1.1.3 基因芯片技术

该方法正处于发展阶段。由于需要昂贵的检测杂交微弱信号的装置，需要具有对杂交信号及相关信息、数据的大规模处理和分析能力，目前应用于转基因检测还比较少。

1.2 基于蛋白质的检测方法

以抗原、抗体为基础的免疫学方法可通过检测外源基因表达的蛋白来定性、定量检测转基因产品。建立这些检测方法通常需要将外源结构基因表达的蛋白产物制备特异性的单克隆或多克隆抗体，建立Western Blot、ELISA法和试纸条法等。

Western Blot方法特异性高，可用于定性检测，尤其适用不溶性蛋白的分析，其检测灵敏度在种子检测中可达0.25%，在烘烤的食品中为1%。但该方法不能进行定量分析，操作繁琐且费用较高，不适合高通量检测。

ELISA方法主要用于定性检测转基因产品，借助于酶标仪，可根据已知标准物质的一系列浓度梯度与吸光度值制作的标准曲线，确定检测样品中目的蛋白的含量。由于缺乏转基因产品的内源蛋白作为对照，ELISA检测方法不能精确定量测定转基因含量，只能达到半定量测定的水平。

免疫试纸条检测方法是根据抗原、抗体特异性结合原理建立的方法，以硝化纤维代替聚苯乙烯反应板为固相载体，将固定有抗体的试纸条或固相带浸入到蛋白提取液中，如果样品中含有外源目的蛋白，试纸条上抗体可与目的蛋白发生反应，产生颜色变化。该方法操作简单、易于操作，一般5～10 min可获得检测结果。但一种免疫试纸条只能检测一种目的蛋白质，不能区分具体的转基因品系，且检测灵敏度较低，为0.15%。

2 转基因检测技术中的存在问题

目前常用的两类转基因生物检测方法各自存在假阳性结果多、标准物研发滞后、灵敏度和准确度低、操作繁琐、效率和通量低、目标蛋白质和抗体制备难等问题，而大样本量和多目标基因的转基因农产品的快速、准确、灵敏的检测，是分析鉴定转基因农产品和了解转基因农产品外源基因的功能及影响的基础，是提高新品种培育效率和构筑转基因农产品安全性的关键步骤，目前国际上还没有一种方法能很好地解决此问题。因此，有必要建立操作简单、高效快捷和精准灵敏的新的转基因生物检测分析方法，以适应当前研究和生产领域的紧迫需求。蛋白质组学技术在转基因检测方法中的应用无疑具有积极意义。

3 蛋白质组学技术在转基因检测中的应用前景

由于许多转基因作物表现出一定的与外源基因相关的蛋白质变化性状，即多数外源基因的表达或调控产物是蛋白质，其表达或调控可能导致蛋白质种类和含量的改变。因而在蛋白质水平上对转基因生物进行检测和研究显得尤为重要。蛋白质是几乎所有生物学过程的功能单位，而蛋白质组(Proteome)是指一个细胞在特定时间和特定环境条件下所有蛋白质的表达。随着蛋白质组学技术的日益发展和完善，蛋白质组学方法在包括植物生长、病理、农产品质量安全等许多研究领域都得到广泛应用，并取得一系列令人瞩目的研究成果。转基因农产品主要是由水和蛋白质组成，因此对其蛋白质组进行分析，就能提供海量的信息，展示参与决定转基因农产品区别于非转基因农产品之间的真正起表达作用的蛋白结构和功能。因此，以蛋白质组学技术平台和最新技术方法为依托，构建新的基于蛋白质的转基因生物检测评价技术体系，是解决当前转基因生物新品种培育和安全性评估监测所面临的检测和研究技术滞后的重要手段之一。

蛋白质组学技术方法是一类以先进仪器设备为支撑，对生物体蛋白质的组成与变化进行高通量、高灵敏度、高分辨率分析研究的新技术方法，大致可分为电泳、色谱和质谱鉴定技术3种。

双向电泳 (two-dimensional electrophoresis，2-DE)技术是目前使用最广泛的一种高分辨率的分离技术。2-DE技术是利用蛋白质的等电点差异，先完成第一向电泳分离，随后利用分子量差异进行二维电泳分离，完成蛋白质样品的高分辨率双向凝胶电泳分离后，比较分析不同样品的蛋白质种类和含量，并将分离到的蛋白质酶解成肽片段后进行质谱鉴定。2-DE仪器和方法较成熟，虽然操作烦琐耗时，且消耗品较贵，但利用2-DE技术，结合质谱鉴定技术，可望避免传统的转基因生物检测技术无法系统了解蛋白质变化的缺陷，满足精细分析生物蛋白质组的需求，从而精确确定外源基因对受体生物蛋白质表达的影响，这方面已有很多报道。

多维液相色谱 (multidimensional liquid chromatography，MD-LC)技术是为适应蛋白质组学研究需要新近发展起来的一类分离技术。MD-LC一般可采用毛细管色谱柱或微色谱柱，蛋白质样品经过在线或离线的离子交换色谱、分子筛色谱、聚焦色谱、反相色谱实现多维分离，并在色谱分离过程中或分离结束后进行酶切，最后直接送入质谱仪进行分析。MD-LC具有分离极端等电点、极端分子质量、低丰度及疏水性膜相关蛋白的特点，可弥补2-DE不易分离这类蛋白的缺陷，在转基因生物分析中，特别是在新基因寻找和基因功能鉴定中，可发挥重要作用。

质谱 (mass spectrometry，MS)技术已广泛用于生物分子的分析鉴定，其中串联质谱的多反应监测技术 (multiple reaction monitoring，MRM)具有在复杂样品中快速定量分析多种痕量成分的特点，是近年来鉴定大样本量材料中已知蛋白质的最有效的蛋白质组学新技术。利用质谱定量蛋白质组技术，特别是MRM-MS/MS技术，可望避免传统的转基因生物检测技术分析目标蛋白质时需先纯化出蛋白质并制备可供使用抗体的缺陷，满足快速和自动化地直接分析转基因生物目标蛋白质的需求。

在转基因农产品安全性检测与研究中，蛋白质组学可发挥寻找新基因、鉴定基因功能、提高分子设计和新品种培育效率、评价转基因农产品安全性等方面的作用，具有重要意义。但无论是基于质谱分析的非标记定量技术，还是基于质谱分析的稳定同位素标记定量技术，在分析转基因农产品时，仍需要进行大量的研究积累，以建立适宜的分析技术体系，从而为转基因农产品研究开发和安全评估提供新的有效的技术支撑。换言之，借助先进的基于质谱的定量蛋白质组学技术方法，构建基于蛋白质的转基因农产品新检测评价和研究技术体系，可克服现在常用的转基因检测方法的一些缺点，实现对转基因农产品中蛋白质变化情况的深入了解，实现对大量样本转基因农产品目标蛋白质的精准、高通量和无标记检测，实现无需抗体和纯化蛋白即可直接对转基因农产品中所有目标基因表达蛋白质的快速精确鉴定。

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