纳米炭和亚甲蓝作为肝癌淋巴引流示踪剂的实验研究

宋伟峰 罗淑媛

中山大学附属第三医院，广东 广州 510630

纳米炭和亚甲蓝作为肝癌淋巴引流示踪剂的实验研究

宋伟峰 罗淑媛

中山大学附属第三医院，广东 广州 510630

目的：探讨纳米炭注射液和亚甲蓝注射液肿瘤淋巴结示踪对肝癌根治手术的应用价值。方法：选用兔VX2肿瘤细胞株，采用开腹腹腔种植法制作兔肝癌模型。将20只新西兰大白兔随机分为亚甲蓝组和纳米炭组，各10只。两组均切除兔肝癌，清扫局部淋巴结，观察肝脏的周围淋巴结转移癌的个数、两种术中示踪剂对淋巴结转移癌的示踪效果。结果：淋巴结染色时间纳米炭组 （100.50± 29.92）s，亚甲蓝组（11.20±4.18）s，有统计学意义（P＜0.01）。淋巴结褪色时间纳米炭组（2.22±0.74）h，亚甲蓝组（1.63±0.54）h，无统计学意义（P＞0.05）；准确性亚甲蓝组87.5%（35／40），纳米炭组87.2%（34／39），无统计学意义（P＞0.05）。结论：兔肝癌模型行肝癌切除和淋巴结清扫手术中应用纳米炭注射液和亚甲蓝注射液对肝癌及淋巴引流具有明显的示踪作用，降低手术清扫的复杂性和危险性，避免传统手术中淋巴结清扫过程的盲目性，能有效降低术后转移淋巴结的残留，能更加安全、便利、快速、彻底地清扫淋巴结。

纳米炭注射液；亚甲蓝注射液；淋巴示踪；淋巴结清扫；肝癌模型

原发性肝癌是危害人类健康的重大恶性肿瘤之一，在与肿瘤相关死亡原因中位列第三［1］。肝癌治疗除肝移植外，仍以外科手术切除为首选治疗策略，但肝癌手术治疗后复发率高，其中重要因素是淋巴结转移导致肝癌细胞转移［2］。肝癌的示踪技术的应用将会提升肝癌患者的综合治疗水平，降低肝癌转移率和复发率。本文通过模拟人体肝癌治疗手术，探讨纳米炭和亚甲蓝注射液对兔肝癌淋巴引流示踪的效果，分析其应用于临床的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 VX2肿瘤细胞株由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物及模型的建立 取日本健康大白兔22只，雌雄不拘，3～4月龄，体重2.5～3.0kg。实验前分笼饲养1周。取健康日本大白兔2只，后腿肌肉中注射细胞计数1× 106／m l的VX2细胞悬液1.0ml，14天后，注射部位形成可触及直径约2cm－2.5cm的类球型肿块，即制成了荷瘤兔。切取肿瘤，剪成1mm×1mm×1mm大小瘤块待用。剩余20只大白兔称重，随机分为两组，一组为纳米炭组，一组为亚甲蓝组。麻醉后，取上腹正中切口进腹，将有齿镊合并起来斜行穿刺肝左叶较厚处，使成一个盲道。夹取2枚瘤块，塞入此盲道最深处，关腹。术后21d兔肝左叶内形成直径约0.8－1cm的类球型肿块。

1.2.2 肝癌淋巴结示踪法 纳米炭组手术步骤：麻醉后，取原切口进腹，用1ml注射器取0.1m l纳米炭注射液于肝脏左叶肿瘤周围2～3点缓慢注射，10s内注射完毕。

亚甲蓝组手术步骤：麻醉后，取原切口进腹，用1ml注射器取0.1m l亚甲蓝注射液于肝脏左叶肿瘤周围2～3点缓慢注射，10s内注射完毕。

两组均记录肝脏周围淋巴结数量、位置，淋巴结明显褪色时间。

1.2.3 组织病理学检查 观察肝癌标本有无包膜、包膜是否完整，有无卫星灶、门静脉癌栓，肿瘤切缘1mm范围内是否有肿瘤细胞。淋巴结标本是否有转移。

1.3 数据统计学处理 数据采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析。经计量资料正态分布和方差齐性检验后，均数±标准差 （±s）表示，采用t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 染料褪色时间 实验时每隔5min肉眼观察，记录染料从第1枚淋巴结染色到最后1枚完全褪色时间。结果发现在淋巴结染色时间上，纳米炭组为（100.50±29.92）秒，亚甲蓝组为（11.20±4.18）秒，有统计学意义（P＝0.000）。淋巴结褪色时间的对比，纳米炭组为（2.22± 0.74）h，亚甲蓝组为（1.63±0.54）h，纳米炭组较亚甲蓝组时间长，但无统计学意义（P＝0.058）。其它指标的对比均无统计学意义。

2.2 淋巴结染色枚数 纳米炭组共检出淋巴结39枚，其中染色淋巴结17枚，平均检出个数（1.70±0.95）枚，未染色22枚，病理证实存在淋巴结癌转移为16枚，无转移为23枚。染色淋巴结有癌转移14枚，染色淋巴结无癌转移3枚，淋巴结无染色有癌转移2枚，淋巴结无染色也无癌转移20枚，准确性87.2%（34／39）。

2.3 亚甲蓝组与纳米炭组的肝癌观察 观察肝癌大体标本，可见两组肿瘤切面均为灰白色、鱼肉状，质地硬，周围正常肝组织边界清楚，无明显包膜。

2.4 淋巴结清扫标本结果的观察 本实验在两组实验动物中，兔肝脏周围最多发现6枚淋巴结，最少为2枚。染色淋巴结的发现部位以肝胃韧带内的肝总动脉旁、胃左动脉旁和肝十二指肠韧带内的淋巴结多见。

3 讨论

在中国除了肝移植外，对肝癌采用外科手术切除是目前首选的治疗方法。但肝癌微转移灶难于发现，局部转移淋巴结清除率低［3］。这将会导致肝癌根治性切除术后的复发。区域淋巴结转移情况是大多数实体肿瘤分期的重要组成部分，也是预后的重要指标。淋巴结清扫是实体瘤根治术中重要的步骤之一，但其在肝癌患者中的作用仍不明确，以往分析影响肝癌预后因素的研究中极少考虑淋巴结转移因素，对肝癌局部淋巴结转移的研究较少［4］，究其原因是当前没有前瞻性的随机对照试验结果来说明系统性清扫淋巴结对肝癌病人是有益的，所以目前尚未对切除原发肝癌的同时，是否进行淋巴结的清扫未能达成共识［5］。

本实验在肝癌外科手术开始时，将经验性、盲目性的肝癌切除和淋巴结清扫手术变为在直视条件下病灶被示踪的 “有的放矢”的切除过程，力争达到降低肝癌手术的癌灶残留和转移淋巴结的遗漏，最终达到降低肝癌的复发，延长患者生存期的目的。

纳米炭注射液内主要成分为纳米炭颗粒［7］，通常以平均粒径150nm的团粒形式存在，可被巨噬细胞迅速吞噬，毛细淋巴管内皮细胞的叠瓦状排列结构，细胞间隙达100－500 nm，基底膜不完整，加上组织液和淋巴液的压力差，淋巴液的向心流动，使得纳米炭粒能迅速进入淋巴管，滞留并集聚于相应淋巴组织使其出现可视性黑染［8］。将这种特性应用到肝癌切除术中直视下寻找淋巴结的操作。综上所述，应用纳米炭和亚甲蓝术中示踪技术，将复杂、易发生医源性损伤的肝脏周围淋巴结清扫手术，变为可视性、安全、稳妥、有效的操作过程，两种染料各具缺优点，染色时间上存在差异，而褪色时间相当，两种染料在肝癌的淋巴结显像效果相当。

［1］王英，李文涛.肝癌干细胞与肝癌的研究进展 ［J］.中国癌症杂志，2011，21（9）：735－738.

［2］钦伦秀，叶青海，汤钊猷.肝癌转移复发的分子机制与预测：从组学研究到临床应用.第十三届中国科协年会第18分会场——癌症流行趋势和防控策略研究研讨会，2011：67－70.

［3］舒宏，康晓楠，刘银坤.肝癌转移、复发预测的蛋白质分子标志物 ［J］.世界华人消化杂志，2010，18（13）：1350－1355.

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1007－8517（2013）13－0074－02

2013.05.07）