转细胞色素P450酶人源化小鼠及应用的研究进展

程一帆，马 璟，严东明

(中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203)

细胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)是肝微粒体中存在的一种与CO结合并在450 nm处存在最大吸收的色素［1］。目前发现的CYP超过500种，共有57个同工酶分属于18个家族和43个亚家族，它们参与介导了体内大部分化合物的代谢过程［2－4］。在新药研发过程中必须在临床前进行大量的动物药效、药代和毒理学研究，但由于CYP酶的种属间差异性，导致动物实验数据外推至人存在不确定性。近年来，利用基因工程和分子生物学技术设计出的转人CYP的人源化小鼠模型为药物的研发提供了极大的便利，转CYP人源化小鼠(CYP humanized mouse)是将人CYP相关基因或者人外源性激活的核受体直接导入或者替代小鼠相关等位基因，制备出可以表达人CYP的转基因小鼠模型。本文综述了转CYP人源化小鼠及应用的研究进展。

1 传统模型及转CYP人源化小鼠模型的优势

CYP酶系，尤其是CYP1-3家族参与了超过75%的临床用药、前致癌物的I相代谢反应以及大量日常膳食和外源化合物的生物转化调控［5－7］。近期对CYP一些酶结构和功能的研究报道，发现酶上特定结构位点能与某些环境因子、污染物产生较强的结合，促进了外源化合物的体内转化［8］。因此，针对CYP的研究，对研究化学物质的生物转化和体内毒性有着极其重要的临床意义和科研价值。

目前研究药物代谢的体外模型有肝微粒体模型、基因重组酶系模型、肝细胞模型、肝-肠灌流模型和肝组织切片模型等。对于体内代谢转化率低、毒性大及缺乏灵敏检测手段的药物来说，体外代谢研究已成为良好的研究手段。但是体外实验脱离体内微环境的支持，并且模型在构建时难免会破坏细胞、器官、组织的完整结构或者使某些蛋白丢失，导致实验结果与体内真实代谢情况具有差异性。此外，体外模型也不方便进行多个代谢产物的同时分析［9］。

为了模拟生物体的整体效果，一般还需要进行体内代谢实验。相较于体外实验，体内实验对靶标物质及其代谢产物的检测具有一定的难度。但是体内代谢模型可以综合考虑各种体内因素对药物的影响，能够真实全面地反映药物代谢的体内整体特征。啮齿类动物已成为体内实验动物模型的较优选择［10－12］。然而，一些实验数据表明，啮齿类动物体内CYP酶系的催化活性与人相比有显著的差异性，因此特定化合物的代谢与人不同。以人CYP2D6和鼠Cyp2d亚家族以及人CYP3A4和鼠Cyp3a亚家族的活性差异尤为显著。大、小鼠和人CYP酶在基因复杂性，基因拷贝量以及它们在组织中的表达分布等多方面有种属差异性［13］。Krausova等［14］研究表明，对于调控CYP基因表达的特定核受体也存在着种属差异，这也是导致大、小鼠和人对外源性物质代谢调控差异性的重要原因。因此，采用普通大、小鼠模型预测外源性物质(如药物)在人体内代谢和相互作用的结果并不理想。

随着基因工程和分子生物学技术的蓬勃发展，以及日渐成熟的转基因和基因融合技术，人们已可以培育出带有靶标基因的转基因小鼠，在小鼠上表达人类基因，就构建出了人源化小鼠模型(humanized mouse model)。人源化小鼠模型通常带有功能性的人类基因、细胞或组织，因此可以模拟人体内环境。通过构建人源化小鼠模型可以解决动物模型实验数据外推至人体时的不确定性问题。近些年来，人源化小鼠模型逐渐被用做人类疾病研究稳定的活体替代模型，有些品系已经应用多年，且没有出现转基因缺失的现象，因而成为研究化合物在人体内作用规律的重要工具。人源化小鼠模型在研究CYP的内源性底物、寻找核受体的配体、药物作用新靶点及疾病相关蛋白［15］以及确定酶和核受体介导的生理药理过程等方面也有重要的应用。

2 人源化小鼠模型的研究进展

1974年Jaenisch等［16］首次报道，通过向小鼠囊胚注入猴(simian)病毒40(SV40)后，40%子代小鼠体内检测到SV40的表达产物，证明了外源DNA整合入胚胎细胞中的可能性。1980年Gordon等［17］通过原核期胚胎显微注射方法制备出了转基因小鼠，开辟了转基因动物研究领域的新纪元。1982年Palmiter等［18］报道，将5'调控区缺失后的大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I基因启动子相连接，培育出“巨型小鼠”，在生命科学领域引起了一场不小的轰动。1985年Smithies等［19］首次证实了哺乳动物细胞中同源重组的存在，奠定了基因敲除的理论基础。1987年Thomas等［20］根据同源重组原理，实现了ES细胞引入外源基因的定点整合，这一技术称为“基因打靶”(gene targeting)。基因打靶技术的问世大大提高了构建转基因动物的成功率和准确率。1993年，Gu等［21］应用Cre/loxP重组酶转染技术实现了外源基因的条件性表达规避了基因打靶可能会导致胚胎死亡的一些不足。目前在转基因小鼠的构建方面比较常用的方法依旧是基因打靶以及利用重组酶转染技术的条件性打靶方式或者基于二者为基础的一些新技术。

转人基因小鼠模型在诸多领域均有应用，其中在研究CYP功能调控，进一步揭示药物代谢毒性反应等方面近15年来也取得了长足的进展。2001年Corchero等［22］成功制备了表达人类CYP2D6的转基因小鼠模型用于药理和毒理的临床前研究，成功解决了由于异喹胍羟化酶(CYP2D6)种属间显著差异所引起的其他动物模型用于毒理评价的缺陷。2003年，Granvil等［23］将包含人 CYP3A4和 CYP3A7基因的BAC(细菌人工染色体)注入敲除掉等位基因的小鼠体内，制备了人源化转基因小鼠模型。2005年，Cheung等［24］用同原理的方法制备了CYP2E1人源化小鼠研究了对乙酰氨基酚的肝毒性。2008年，Felmlee等［25］通过将分别携有CYP2D6和CYP3A4的小鼠进行交配，成功构建了转CYP3A4/CYP2D6的双转基因小鼠，并研究发现在不同发育阶段和不同性别的个体中CYP会受到多种多样的外源性因素影响。综上所述，克服了种属间差异性的人源化小鼠模型是研究CYP的功能和药物在人体内代谢规律的最优选择。

3 转CYP人源化小鼠的分类

转人CYP人源化小鼠根据转入酶的不同进行分类，目前主要有转人CYP1A亚家族、CYP2D6、CYP3A亚家族、孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)/CYP3A4，CYP4F2和CYP2E1等人源化小鼠模型。

3.1 转CYP1A亚家族人源化小鼠

CYP1A亚家族包含了CYP1A1和CYP1A2两种酶。外源性物质经CYP1A代谢产物包括多环芳香族碳氢化合物(PAH)、杂环胺和杂环芳香胺等多种化学致癌物［26］。

利用BAC技术将编码人CYP1A1和CYP1A2的基因转入鼠源CYP1A1和CYP1A2敲除的小鼠中，形成相应的人源化小鼠。通过对CYP1A的mRNA拷贝数、蛋白表达水平以及相关酶活性等参数的检测结果显示，人源化小鼠肝内CYP1A1和CYP1A2表达情况与人体内表达情况类似。对人源化小鼠和野生型小鼠给予CYP1A1特异性底物〔苯并(a)芘和乙氧基试卤灵〕和CYP1A2特异性底物(乙酰苯胺和甲氧基异酚二唑)代谢后检测得到的实验结果显示，人源化小鼠肝内的CYP1A1催化苯并(a)芘的羟化效率比野生鼠源CYP1a1的催化效率低97.4%到99.4%，且7-乙氧基异吩噁唑酮脱乙基酶活性也低约98.1%。与此不同的是，两者表达的CYP1A2的功能几乎相同。综上所述，鼠和人的CYP1A底物特异性变化比较大且这些变化与CYP1A的表达水平或蛋白浓度无关，但只要注意这些变化，转CYP1A人源化小鼠依旧可以作为安全性评价、毒理学、药理学和一些疾病治疗的有效工具［27－28］。

3.2 转CYP2D6人源化小鼠

人CYP2D6酶参与了超过25%市售药物的体内代谢。然而CYP2D6酶的种属差异性比较大，大鼠和小鼠至少含有5种CYP2D基因，但无一能编码与人相同的CYP2D6活性。因此，缺乏动物模型研究CYP2D6多态性，而人源化CYP2D6小鼠模型可对弱、强代谢型不同表型的研究提供手段。这使得应用普通动物模型很难预测CYP2D6介导的药物代谢［29－31］。

在人源化CYP2D6(humanized CYP2D6，hCYP2D6)小鼠，野生型小鼠和CYP2D敲除小鼠中通过Western蛋白质印迹法进行检测，发现在hCYP2D6小鼠体内CYP2D6在肝，十二指肠和空肠均大量表达;回肠微粒体检测结果表明，相较于小肠的其他部位其CYP2D6的表达略微降低。此外，在肾微粒体中也检测出了CYP2D6的表达。而在野生型小鼠和CYP2D敲除小鼠提取的组织微粒体中均无法检测出CYP2D6的表达。与之相反的是相应的鼠源CYP2D基因表达产物在野生型小鼠体内大量表达而在hCYP2D6和CYP2D敲除小鼠表达甚少。野生型和hCYP2D6小鼠体内CYP2D6底物的药代学研究中，分别检测野生型和hCYP2D6小鼠在给予奎尼丁前后丁呋洛尔的代谢变化和异喹胍在两者体内的代谢情况。结果显示，野生型小鼠体内丁呋洛尔的消除较快，这与其1'-羟化酶活性较高的体外实验结果一致。联合给予奎尼丁后，hCYP2D6体内丁呋洛尔暴露量增加，而野生型小鼠体内无明显变化，这与体外实验结果一致，验证了奎尼丁是人CYP2D6的选择性抑制剂。野生型小鼠与hCYP2D6小鼠体内异喹胍代谢实验结果显示，野生型小鼠体内异喹胍的暴露量很高，这与hCYP2D6小鼠体内 4'-羟化酶活性较高的实验结果一致。因此，转CYP2D6人源化小鼠是检测CYP2D6选择性抑制剂和特异性底物的良好工具［29］。应用该人源化小鼠模型对于揭示该酶介导的体内药物代谢和药物相互作用中个体差异的原因，及在新药研发和毒性评价等方面均具有重要的价值。

3.3 转CYP3A亚家族人源化小鼠

人类第7号染色体上有编码CYP3A家族的基因，CYP3A亚家族包含了4个同源基因(CYP3A4，CYP3A5，CYP3A7和CYP3A43)。小鼠CYP3A亚家族包含了7个编码基因，但是与人的编码基因并没有同源性。说明人的CYP3A中的各个同工酶来自于同一祖先。通过最新的质谱阳 离 子 检 测 发 现［32］，CYP3A4，CYP3A5，CYP3A7 和CYP3A43结构相同的部分达到85.4%。CYP3A4是P450酶系中在小肠中表达的主要代谢酶，参与了众多口服药物的首过代谢，其表达水平与在肝脏中表达水平无相关性。人CYP3A4与小鼠CYP3A家族之间存在着显著的种属差异性，普通小鼠不能很好的预测由CYP3A4介导的药物代谢。

Granvil等［23］利用 BAC克隆技术，将一个上游带有PXR-位点的全人CYP3A4基因导入到小鼠体内表达，生成人源化小鼠。检测小鼠的肠微粒体发现，人源化小鼠小肠较野生型小鼠高度表达CYP3A4。口服给予CYP3A4探针药咪达唑仑，显示人源化CYP3A4小鼠对其的代谢清除率远高于无CYP3A4的野生型小鼠，而静脉注射给予此药在小肠内代谢清除率无明显差异。同时口服给予CYP3A4抑制剂酮康唑，发现咪达唑仑的清除率降低，验证了咪达唑仑和酮康唑间潜在的药物相互作用。van Waterschoot等［33］设计实验将人CYP3A4基因转入CYP3A敲除的小鼠生成转CYP3A4人源化小鼠，应用三唑仑作为探针药进行检测。与结构类似物咪达唑仑相比，三唑仑较其他鼠源CYP酶来说是更好的CYP3A特异性底物。通过检测小鼠体内三唑仑代谢产物1'-OH-三唑仑和4-OH-三唑仑的浓度来评估野生型小鼠、CYP3A敲除［CYP3A(－/－)］小鼠、转人 CYP3A4基因(CYP3A4-Tg)小鼠体内代谢活性情况。提取相应的小鼠肝微粒体进行检测，野生型小鼠微粒体中检测出三唑仑代谢产物为1'-OH和4-OH三唑仑，其代谢反应符合米氏动力学。三唑仑低浓度时，主要产物为1'-OH三唑仑，随着三唑仑浓度升高，主要代谢产物转为4-OH三唑仑。在CYP3A(－/－)小鼠肝微粒体中检测结果显示，三唑仑的代谢程度大大降低，几乎无法代谢。与野生型小鼠相比1'-OH三唑仑浓度降低了97.5%而4-OH三唑仑浓度降低92.8%。在CYP3A4-Tg小鼠体内，仅在肝组织处表达CYP3A4，与野生型相比展现出不同的药代动力学轮廓。CYP3A4与三唑仑的亲和力比鼠CYP3A的小80.0%，但其代谢三唑仑产生1'-OH三唑仑的最大反应速率与鼠源CYP3A相比提高了3倍。因此，在CYP3A4-Tg小鼠中生成1'-OH-三唑仑的固有清除率与WT小鼠相比仅降低了38.3%，而生成4-OH-三唑仑代谢反应的固有清除率还增加了2.1倍。这些实验结果与人肝微粒体体外实验结果很相似，且药代动力学参数也处于同一水平［33］。

综上所述，利用转人CYP3A4人源化小鼠研究CYP3A4介导的药物代谢，可以得到与人体代谢相似的实验数据，为研究药物在体内的代谢，评估药物间的相互作用，预测药物的潜在危险提供了宝贵的方法。

3.4 转PXR/CYP3A4双转基因人源化小鼠

核受体PXR和构雄烷受体(contitutive androstane receptor，CAR)由DNA结合域和配体结合域组成，其配体结合域可以与众多药物配体(如巴比妥类、利福平、他汀类药物、钙拮抗剂、咪达唑仑)相结合。经配体活化的PXR发生构象改变后，作用于CYP3A4基因启动子区的DNA应答元件诱导其转录表达［34－36］。PXR与不同配体的亲和力具有种属差异性。例如利福平作为典型的PXR配体而不能活化大鼠PXR。这种种属差异限制了动物模型在药物代谢研究领域的应用。构建PXR-CYP3A4的人源化小鼠可以使得更多药物在动物体内的代谢测试更准确，促进药物临床前安全性预测［37］。

MA等［38］设计出一种双转基因人源化小鼠(TgCYP3A4/hPXR)。用这种双转基因的小鼠模型进行研究，使得人体内PXR-CYP3A4介导的利福平-蛋白酶抑制剂间的相互作用得以重现，利福平预处理的TgCYP3A4/hPXR小鼠的肝微粒体中，安普那韦，奈非那韦和沙奎那韦的代谢稳定性分别下降了52%，53%和99%。经利福平预处理的小鼠体内实验结果发现，血清安普那韦的药时曲线下面积降低80%［38］。这些结果表明，这种双转基因小鼠可以用于体内CYP3A4转录和功能表达的研究。

PXR/CYP3A4人源化小鼠有着转人PXR或转人CYP3A4小鼠无法比拟的优势，其在药代动力学、检测PXR激动剂和抑制剂、在抑制炎症和对人类疾病的调控等研究领域中的应用取得了良好的效果［39］。

3.5 其他人源化小鼠

CYP4F2，CYP4A11和CYP4F3B被认为是代谢花生四烯酸的主要酶类。花生四烯酸可以被环氧合酶以及脂氧合酶分解成前列腺素，前列环素，血栓素以及白三烯类，对心血管疾病的防治有着重要的作用。有报道称，转CYP4F2基因在外源启动子的激动下，可以增加花生四烯酸的含量［40］。刘晓亮等［41］将 pKAP-CYP4F2利用显微注射技术导入FVB/N小鼠产生转基因小鼠。通过Western蛋白质印迹法，在所有肾部样品中检测出CYP4F2的表达，从而验证了转CYP4F2小鼠模型的成功构建。对人源化小鼠体内花生四烯酸进行研究表明其与体内高血压的形成有关。过量表达CYP4F2可以造成花生四烯酸产量增加从而促进高血压的生成，因此，转CYP4F2小鼠模型的构建对于研究高血压的形成和治疗将会很有意义。

Lu等［42］设计应用野生型小鼠、CYP2E1敲除小鼠以及转CYP2E1人源化小鼠研究乙醇诱发的肝损伤。在给予高浓度乙醇饲料连续饲养之后，他们发现脂肪肝和氧化应激反应存在于野生型小鼠和人源化CYP2E1小鼠中并且在人源化小鼠中肝损伤更为显著。CYP2E1敲除小鼠体内这些现象减弱。利用这种模型，可以揭示过度饮酒造成的损害，进一步揭示乙醇对肝损伤的机制。

4 展望

转CYP人源化小鼠模型的研究目前主要集中在构建转CYP1～3家族的人源化小鼠。利用这些模型进行药代动力学和药物安全性评价可以得到比普通小鼠更真实可靠的外推数据。近些年国内外已有公司构建了人源化CYP2D6小鼠模型、人源化 CYP3A4/3A7小鼠模型、人源化 Liver CYP3A4小鼠模型和人源化PXR-CAR-CYP3A4/CYP3A7小鼠模型等产品进入商业市场。这些商业化供应的人源化小鼠广泛应用于体内代谢酶的作用机制研究和新药研发的相关过程。近年来随着分子生物学的深入研究，一些实验室构建了新靶点的CYP人源化小鼠，用来研究代谢酶参与的癌症发病机制和外源化合物引起的毒性反应。这些将为探索生命科学的奥秘、揭示疾病和健康的关系提供强有力的支持。

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