内皮祖细胞在肿瘤临床诊断与治疗中应用的研究进展

蒋 艳，张 彦，陈翠京

(军事医学科学院附属医院超声科，北京 100071)

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)是能分化为成熟内皮细胞的细胞，不仅参与胚胎时期的血管新生，还参与出生后的血管生成、血管再生和内皮修复。EPC来源广泛，近年来，相继发现其存在于人的脐血、骨髓、外周血、骨骼肌、脂肪和心脏等组织中，同时EPC在肿瘤临床诊断和治疗中的应用研究取得一定进展。

1 内皮祖细胞的来源、结构和功能特点

早期的EPC出现于胚胎第15天左右，参与胚胎时期的血管新生。出生后的EPC主要存在于骨髓中，机体需要时在多种细胞因子作用下迁移至外周血，循环归巢至缺血组织参与血管新生［1］。研究表明，骨髓中亦存在 2 种 EPC［2］。一种是早期EPC，来自于外周血单个核细胞，呈集落样生长，培养3～5 d后呈现纺锤形，第2～3周时达生长高峰，第4周时逐渐死亡消失;另一种是晚期EPC，来自于骨髓的单个核细胞，少量存在于外周血，呈铺路石样生长，培养第2周～第4周时，其细胞集落出现在早期EPC中间，呈鹅卵石形，第4～第8周呈指数生长，第12周逐渐死亡消失。两种EPC均能摄取结合FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ(FITC-Ulex europaeus agglutinin-Ⅰ，FITC-UEA-Ⅰ)和 DiⅠ标记的乙酰化 低 密 度 脂 蛋 白 (DiⅠ-acetyl low density lipoprotein，DiⅠ-acLDL)且双阳性细胞无明显差异。晚期EPC中血管内皮生长因子 2(vascular endothelial growth factor-2，VEGF-2)的表达更高，而早期EPC CD133表达更高。说明晚期EPC具有更强的增殖和形成新生血管的能力，早期EPC则具有更强的迁移能力［3］。虽然EPC既有内皮细胞特性，又有祖细胞特性，也表达相应的表面分子，但是目前尚无特异性的细胞表面标志物。目前比较公认的是把同时具有 CD34，AC133和 VEGFR-2表面标志，并可吸收DiⅠ-acLDL、结合FITC-UEA-Ⅰ的EPC认为是正在分化的EPC［4］。目前，关于EPC表面标志物的研究也在不断完善和更新。最近Mund等［5］研究认为，真正意义上的EPC是在CD146+CD45－细胞群内。

2 肿瘤与血管新生

肿瘤是克隆性异常增生的病变，其行为特点决定了其需要大量的营养物质和氧气的供应。而充足的氧气和营养物质供应就需要大量的血管和血液提供。一般认为，肿瘤的生长可分为无血管期和血管期。无血管期肿瘤主要依靠周围组织的弥散来获取营养物质，排泄代谢产物，肿瘤生长较缓慢，肿瘤组织极少超过2～3 mm。血管期肿瘤内出现新生毛细血管并获得进一步生长的能力，肿瘤迅速生长并可发生远处转移。大多数肿瘤组织起初以无血管的方式生长，直到其增殖和凋亡速率达到平衡，基本维持在封闭的休眠状态。而肿瘤一旦从休眠期苏醒，进入血管期，对营养物的依赖性则更强，直至达到一定大小。因此，肿瘤的生长、侵袭及转移均具有高度的血管依赖性［6］。

3 内皮祖细胞与肿瘤

肿瘤血管的新生既包括肿瘤诱发的血管生成，即在原有血管基础上向肿瘤组织方向以出芽方式形成血管的过程，也包括了血管发生，它是由EPC归巢至血管新生位点参与血管新生。Rehman等［7］报道，体外培养的EPC能够分泌多种促血管生长因子，如VEGF、粒细胞集落刺激因子和粒巨细胞集落刺激因子等，通过自分泌和旁分泌效应可以促进血管生成过程，有利于新生血管的形成。肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞释放的细胞因子和化学因子可以诱导单核细胞进入肿瘤组织，而且EPC一旦进入肿瘤组织将被诱导表达促血管形成因子和肿瘤促进因子，包括VEGF、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子和基质金属蛋白酶，尤其是VEGF，即肿瘤的生长和EPC的发育分化具有相互促进的作用。大量的研究证明，EPC参与肿瘤血管新生，大多数肿瘤患者外周血中EPC的增多与肿瘤的分期及大小呈正相关［8－10］，并且与患者的生存率呈负相关［11］。

4 内皮祖细胞在肿瘤研究中的应用

基于EPC作为内皮细胞的前体细胞，并且具有高度的增殖潜力，其在血管相关性疾病中的应用价值甚大。肿瘤的血管依赖性决定任何可以干扰血管形成的物质皆可对肿瘤的生长造成影响，从而抑制肿瘤生长。目前EPC在肿瘤研究中的应用主要集中于两个方面，一是通过半定量测定肿瘤患者体内EPC含量，以其作为生物标志物用来衡量、判定肿瘤良恶性、肿瘤的分期及疗效评估等;二是直接应用于肿瘤治疗，通过EPC干扰阻滞血管生成达到抑制肿瘤生长的目的。

4.1 内皮祖细胞作为肿瘤的生物标志物

肿瘤的标志物是可以反映肿瘤存在和生长的一类物质，可以由肿瘤组织自身产生，也可由肿瘤与宿主相互作用后产生，如与肿瘤发生密切相关的多态性的单核苷酸和微RNA等，它们在正常组织中检测不到或在肿瘤组织中的含量远远超过正常组织。目前临床上常用的肿瘤标志物主要有两类，一类是癌胚蛋白，如原发性肝癌最灵敏最特异的标志甲胎蛋白和提示消化道肿瘤的癌胚抗原等;另一类是肿瘤抗原，包括糖类抗原19-9(CA19-9)(较正常值升高主要提示胰腺癌)、糖类抗原125(CA125)(明显升高主要提示卵巢癌与子宫内膜癌)和前列腺特异性抗原等。而肾细胞癌和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma，NHL)等肿瘤患者的外周血中并未发现类似上述特异性和敏感性的标志物，乳腺癌化疗疗效的评估亦缺乏相应的外周血指标。目前EPC的研究有望补充该指标。

Yang等［12］分析55例肾细胞癌患者、33例肾良性肿瘤患者和40例健康志愿者外周血循环EPC水平，并研究其与血清内皮生长因子的关联性，发现肾细胞癌患者外周血中EPC水平(0.28%)明显高于肾良性肿瘤患者(0.017%)和健康志愿者(0.076%)，并且Ⅲ期和Ⅳ期肾细胞癌患者较之Ⅰ期和Ⅱ期患者更高(0.339%vs 0.243%，P ＜0.01)。病灶＞7 cm肾细胞癌患者EPC平均为0.331%，明显高于病灶≤4 cm的患者(0.225%)和病灶4～7 cm的患者(0.231%)(P＜0.01)，并且 EPC 水平与患者血清 VEGF水平呈正相关。该研究提示，EPC有可能作为一种新型肾细胞癌的生物标志物。

Yu等［13］用流式细胞仪分析41例NHL患者和16名健康受试者外周血中 CD133+，CD34+和 VEGFR-2(CD309)+细胞百分率，发现NHL患者循环EPC百分率明显高于对照组，而且Ⅲ～Ⅳ期NHL患者循环EPC百分率显著高于Ⅰ～Ⅱ期NHL患者。NHL患者EPC百分率与性别和病理类型无相关性。为此，他们建议将NHL患者循环EPC的过度增加作为一种新的生物标志物可用于NHL患者的诊断和分期。

Kuo等［14］检测乳腺癌化疗患者循环内皮细胞、有活性的循环内皮细胞和循环EPC发现，从第一个化疗周期的第1天起三者均显著减少。化疗1周后，循环内皮细胞和有活性的循环内皮细胞均恢复到第1天的水平，循环EPC仍然较低，但是逐步回升，直到下一个化疗周期。经过6个周期的化疗，循环内皮细胞和有活力的循环内皮细胞总数走向减少的趋势，而循环EPC朝着增加的趋势发展，其中一些临床因素如肿瘤的类型、化疗方案和粒细胞集落刺激因子的使用等并未对此产生显著影响。在将来通过抑制血管生成并结合化疗治疗肿瘤的研究中，循环内皮细胞和循环EPC数量在每个化疗期间和化疗后的变化，对于将循环内皮细胞和EPC作为血管发生的替代标记物提供实验依据。

4.2 内皮祖细胞作为抗肿瘤药物用于肿瘤治疗

肿瘤的治疗手段主要是手术切除、放疗和化疗。目前免疫治疗成为第4种肿瘤治疗模式，常作为一种辅助疗法与手术、放疗和化疗等常规治疗联合应用。但是针对不同的病理类型、不同的肿瘤分期和不同的治疗方案，常规的治疗在部分肿瘤患者中仍不能达到满意的效果。EPC的抑血管效应显示出其在肿瘤治疗中的潜力，成为肿瘤治疗的一个新的发展方向。

Su等［15］通过对22例卵巢癌患者和15例健康受试者的循环EPC培养，研究EPC中DNA结合/分化抑制子1(inhibitor of DNA binding/differentiation 1，ID1)在卵巢癌患者血管新生中的作用以及其信号转导通路，发现在卵巢癌患者中，ID1通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶和NF-κB/基质金属蛋白酶2信号通路可以增加EPC的血管新生。推测如果运用特异性抑制剂阻滞这种通路可能将消除ID1对EPC的增强效应，从而抑制肿瘤的生长，预示了其在卵巢癌治疗中的潜力。

慢性应激会促进肿瘤血管生成，然而其机制尚未完全阐明。Jiang等［16］假设，慢性应激通过交感神经的神经递质α1肾上腺素能受体诱导激活EPC细胞外调节蛋白激酶和β2AR内皮型一氧化氮合酶信号通路来增加肿瘤血管生成。这一假设尚需通过临床和动物实验予以确证。如果该假设得到验证，将有可能对新的抗肿瘤药物的研发产生影响。

Huang等［17］检测前列腺癌细胞缺氧24和48 h条件培养基分泌细胞因子的变化规律，发现其增殖、迁移和血管发生能力等功能变化与相同培养条件下骨髓来源EPC一致，表明前列腺癌细胞在缺氧早期阶段具有通过分泌细胞因子来调整自身微环境，以促进骨髓来源EPC迁移和血管生成的潜力。

针对部分乳腺癌患者在常规治疗后长达数年甚至几十年休眠后出现转移的现象，Ghajar等［18］研究发现，内皮细胞诱导了持续静止的乳腺癌细胞。稳定的微血管系统构成了肿瘤弥散细胞的休眠龛(dormant niche)，而肿瘤弥散细胞休眠龛的主要成分是基膜。由于乳腺癌细胞必须通过血源途径以到达乳腺肿瘤最常转移的部位如肺、骨髓、大脑和肝脏，所以微血管基膜将是肿瘤细胞扩散到这些组织遇到的第一道屏障。内皮细胞和因子(例如凝血酶敏感蛋白-1)就沉积储存在基膜周围。通过器官微血管龛的蛋白质组学和蛋白质沉积物的功能分析，鉴定凝血酶敏感蛋白-1是内皮衍生的肿瘤抑制基因。更重要的是，凝血酶敏感蛋白-1在萌芽的新生血管附近减少，表明在这种龛下肿瘤可能逃脱生长调节。说明内皮细胞直接影响了乳腺癌细胞的增长。这些问题是设计通过支撑肿瘤细胞休眠，或用最小的剂量选择性地杀灭休眠细胞来预防复发而避免损伤正常组织的关键。EPC作为内皮细胞的前体细胞，亦能在预防乳腺癌复发中起到重要作用。

4.3 内皮祖细胞作为基因载体用于肿瘤治疗

基因治疗是指将有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以发挥作用，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗的载体大致可分为病毒型载体和非病毒型载体。在过去多年的临床试验里，基因治疗的效果不尽如人意，其中不良反应成为人们关注的主要问题。EPC作为载体，不仅无病毒型载体潜在的致癌性、自身免疫原性，无排斥反应［19］，且靶向性高，系统毒性低。Hamanishi等［20］通过逆转录病毒将小鼠CC趋化因子配基19(CC chemokine ligand 19，CCL19)基因导入胚胎EPC，此基因表达后可产生一种淋巴细胞迁移趋化因子。在B6C3F1型小鼠皮下接种小鼠卵巢癌HM-1型细胞，配合小鼠体内注入导入CCL19基因的胚胎EPC，表现出免疫活性和肿瘤抑制效应。与对照组相比，胚胎EPCCCL19组荷瘤小鼠体内肿瘤组织具有更多的CD8+淋巴细胞，显示出了肿瘤抑制效应。Zhang等［21］将胸苷激酶基因修饰的EPC注入带有神经胶质瘤的裸鼠体内，配合更昔洛韦(ganciclovir)治疗后，通过细胞凋亡和微血管密度的分析来评估其抗肿瘤效应。结果显示，配合更昔洛韦治疗后，胸苷激酶基因修饰的EPC对神经胶质瘤细胞和人脐静脉内皮细胞显示出潜在的旁观者效应。通过多次静脉注入胸苷激酶基因修饰的EPC，可抑制血管生成而产生抗肿瘤效应。Varma等［22］在人神经胶质瘤小鼠模型内利用EPC作为载体于肿瘤部位基因表达人钠碘同向转运体，并通过单光子发射计算机断层成像术检测到了EPC的迁移及人钠碘同向转运体基因的表达。研究表明，EPC能够作为基因载体对神经胶质瘤进行基因治疗。

但是，在EPC的研究应用中仍然存在很多有待更深入研究的问题。一是寻找能真正代表EPC的具有较高特异性的表面标志物，目前还没有某一类单独的具有特异性的表面分子可以代表EPC;二是由于肿瘤的病理类型不同、肿瘤的不同分期，EPC的作用也存在差异，找到EPC在不同病理类型、不同肿瘤分期中的相应机制，能更好地指导临床应用。

5 结语

EPS高度的增殖潜力和定向生成血管内皮细胞的能力为肿瘤的研究和治疗开辟了新途径。临床研究和动物实验研究提示，EPC在应用于治疗肿瘤和作为肿瘤生物标志物方面具有很大的优势。但EPC的临床应用还处于探索性阶段，尚未真正作为一种治疗手段应用于临床，相关机制研究还需更深入的研究。由于EPC的功能特性和优势，个性化治疗方案可能为不同的患者提供更个性化的治疗，在提高疗效的同时可减轻患者因单纯放、化疗以及手术治疗带来的痛苦。

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