蚊虫Wolbachia野外试验的研究进展

张东京，梁格豪，郑展图，刘秀婷，何石萍，叶慧珍，李卓雅，詹希美，郑小英

2.中山大学中山医学院临床医学院，广州 510080

登革热（Dengue Fever，DF）主要是人由于感染登革病毒（Dengue Virus，DENV）而引起的一种蚊媒传染病，该病传播媒介主要是埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedesalbopictus）。根据WHO发布的文献显示，近几十年来世界DF的发病率在逐步上升，约有25亿人生活在有可能感染DENV的疫区，全球每年约有5 000万到1亿人感染，其中以东南亚和西太平洋地区最为严重，在2008年和2010年报道的病例分别超过120万和220万［1］。目前尚无特效的治疗药物和安全可用的疫苗，因此对DF流行的控制主要还是以化学杀虫剂控制媒介蚊虫为主。然而化学杀虫剂的长期使用，也带来了一些副作用，如环境污染、生态环境破坏和蚊虫抗药性等。因此利用生物防治来控制DF已被越来越多的科学家所认可。

最近，利用共生菌沃尔巴克氏体（Wolbachia）作为一种生物制剂来减少蚊虫种群数量和阻断DENV传播已经取得很大的进展。Wolbachia是一种类似立克次体的共生菌，广泛存在于昆虫和其他节肢动物的细胞内，基因组大小约为1.36 M kb，有A－H等多个亚群［2］。该共生菌能调控宿主的生殖，并可以垂直传播，使感染的雌虫宿主拥有生殖优势，包括细胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility）、雌性化（parthenogenesis inducing）、杀雄效应（male killing）和孤雌生殖（feminizing）［3］。

Wolbachia被视为可以抑制昆虫和它所传播的病原菌的一种潜在生物制剂，已在缅甸、澳大利亚［4］和越南［5］等国家开始进行野外放养感染有Wolbachia蚊虫的实验，并取得了初步的成效。本文就近年来Wolbachia蚊虫野外试验技术条件、生物安全情况和存在问题与展望作一综述。

1 Wolbachia蚊虫野外试验技术条件

Wolbachia于1912年由Hertig和Wolbac在尖音库蚊（Culexpipiens）的生殖细胞中被发现，随后其与宿主的作用才慢慢被人们所了解［6］。虽然自然界中存在着丰富的Wolbachia共生菌资源（约40%的节肢动物存在感染）［7］，但真正使科学家们认为该共生菌能够运用到实践中的关键技术是运用了蚊卵显微注射，成功地将它进行种群间的转染［8］。例如DENV重要传播媒介白纹伊蚊虽然存在自然双重感染，但仍可以传播该病毒，而其它重要蚊媒病传播媒介埃及伊蚊和按蚊等自然没有感染该菌，因此如不能从其他昆虫物种转染新的Wolbachia菌系，这会极大地限制了该共生菌的实际运用。转染的菌系必须满足4个条件：1.可以垂直传播和诱导宿主发生CI；2.可以干扰或阻断RNA病毒复制；3.在蚊虫的传播疾病的重要器官含量达到抑制病原体的最低密度；4.可以快速入侵野生种群，完成种群替代。

1.1 种间转染 通过蚊卵显微注射，成功地从白纹伊蚊蚊卵细胞质中的Wolbachia转移到埃及伊蚊蚊卵内，孵化后的成蚊感染率达到100%，可诱导宿主发生CI和垂直传播［8］。由于蚊卵显微注射对卵造成的伤害比较大，后期孵化率不高，Ruang－areerate等［9］通过成蚊的胸腔注射Wolbachia，虽然存活率高，但是感染率并不能达到100%，且后代感染率仅稳定在45%左右，Cook等［10］认为这是由于通过成蚊注射的蚊虫生殖腺感染密度不高，从而导致垂直传播效率低。虽然蚊卵显微注射技术要求较高，但蚊卵一旦成功孵化，感染率可达100%，且产生的后代不会出现丢失该菌的情况［11］，因此蚊卵注射比成蚊注射更加科学有效。不同的Wolbachia类型对宿主的适应情况是不同的，有些亚群可以直接从自然宿主转移到异常宿主体内，如将白纹伊蚊体内wAlb A和wAlbB转移到埃及伊蚊体内［8］。而有些亚群对新宿主的适应性不强，无法直接感染新宿主或者垂直传播效率过低，这必须让该菌系在新宿主的细胞体系外进行培养，经过多代的培养适应后慢慢适应新宿主，但这过程一般需要几年的时间。如必须将黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）体内wMelpop在埃及伊蚊RML－12细胞株经过体外多次传代培养后，才能成功地转染到埃及伊蚊体内，并且有非常高的垂直传播效率［10］。

1.2 阻断病毒wMelpop属于Wolbachia的 A亚群，其自然宿主为黑腹果蝇，研究发现wMelpop可以干扰其宿主体内的果蝇C病毒的复制，与没有感染该菌的宿主相比，可以延迟宿主的死亡［12］。同样，Bian等［13］也在感染wMelpop埃及伊蚊体内也发现相似的情况，感染蚊虫体内DENV的拷贝数显著低于没有感染的蚊虫。近来研究还发现，wMelpop不仅对DENV有阻断作用，对基孔肯雅肯亚病毒（Chickungunya Virus）、鸡疟原虫（Plasmodium gallinaceum）等也有抑制作用，说明该菌系拥有一种广泛的阻断病毒在宿主体内复制作用，然而具体机制仍不清楚［14］。Pan等［15］认为Wolbachia能诱导宿主体内发生氧化还原反应，激活“Toll通道”，从而抑制宿主体内病毒的复制。Frentiu等［16］则在细胞水平发现Wolbachia抑制病毒能力取决细胞内Wolbachia的密度，认为是该共生菌与细胞内病毒处于同一个细胞内，或存在着竞争宿主营养，从而干扰病毒在细胞内的复制。

1.3 组织分布 埃及伊蚊和白纹伊蚊是传播DENV的两种主要媒介昆虫，前者无自然感染Wolbachia，而后者是自然双重感染（wAlb A 和wAlbB）。Bian等［17］将wMelpop转染到埃及伊蚊体内后，发现蚊虫的各个组织器官（包括头部、脂肪体、中肠、唾液腺、马氏管和卵巢）均能感染wMelpop，且该菌含量在蚊虫中肠和唾液腺这两个组织器官中均能达到干扰DENV复制的密度。虽然白纹伊蚊存在自然超感染，但在中肠和唾液腺这两个组织器官该菌的含量非常低，Lu等［17］在双重感染不同浓度菌量Wolbachia的白纹伊蚊Aa23细胞中加入 DENV，发现随着菌量增加，细胞中干扰DENV的能力不断上升，说明了即使白纹伊蚊自然存在双重感染，但由于在中肠和唾液腺等病毒复制的部位菌量非常低，达不到干扰病毒复制的密度，因此才成为 DENV 的传播媒介。Blagrove［18］等将wMel转移到无感染的白纹伊蚊体内（四环素清除共生菌），建立起单感染wMel的白纹伊蚊，转染后该菌在白纹伊蚊体内的唾液腺含量相对高，喂养含DENV血餐后解剖蚊虫的唾液腺，没有发现DENV颗粒，而空白对照仍可发现DENV颗粒。这说明人工转染Wolbachia后，共生菌能否在中肠、唾液腺和卵巢等重要部位达到一个相对高的密度，这对于干扰或阻断病毒复制和能否垂直传播是必不可少的。

1.4 种群替代 感染wMelpop要入侵到野生种群中，首先该菌必须能够诱导宿主发生CI，并且在宿主生殖腺中密度相对较高，以保证高效率垂直传播［3］。Mc Meniman 将［11］感 染wMelpop 的 埃 及 伊蚊雄蚊与没有感染的雌蚊交配，诱导宿主发生CI，并对转染了wMelpop埃及伊蚊的后代（第30、35代）进行随机抽取检测，发现仍是100%的阳性率。其次，wMelpop入侵种群速度必须足够快，Walker等［19］在模拟自然环境的人工实验室A和B中，释放感染wMelpop的雌性埃及伊蚊，释放比例都在0.65，随着时间的增长，蚊虫的感染率不断上升，并分别在30 d和80 d后感染率达到一个稳定值，均接近100%。而在野外实际放养中，wMelpop的入侵速度也是非常高，Hoffmann等［4］在澳大利亚东北部凯恩斯港口的Yorkeys Knob和Gordonvale释放感染了wMelpop的雌性埃及伊蚊，并于3个月后发现这两个释放点埃及伊蚊wMelpop的感染率分别达到100%和90%。Wolbachia无论在实验室或者在野外实践放养中，都能够诱导宿主发生CI，且入侵种群的速度是也是很快，可能只需要2～3代便可完成种群的替代。

2 Wolbachia蚊虫的生物安全情况

将感染了Wolbachia的蚊虫进行野外放养，是否会影响生物安全，对人类、动物或者环境和生物链造成不利的影响，这是人们对Wolbachia野外实践运用最关心的问题：

2.1Wolbachia对人或者动物安全性 感染有Wolbachia的蚊虫是否能通过叮咬人或者动物从而将体内的共生菌注入到人或者动物体内，从而产生不良的影响。Wolbachia是一种严格的细胞内共生菌，自然界中多种昆虫均有感染，而在人类或者其他哺乳动物体内并没有发现感染。人们将感染有Wolbachia的黑腹果蝇卵巢研磨后注射到鸡胚和幼鼠的胸腔和大脑，均没有发现由该菌所引起的症状和死亡［20］。一些实验数据也说明Wolbachia是不会转移到人类或者动物体内。电镜结果表明，Wolbachia的大小直径大约1～2μm，而蚊虫的唾液腺导管的直径小于1μm，这意味着即使该菌存在于分泌的唾液中，也不可能通过蚊虫的叮咬将它注入到人类或者动物体内［21］。Western blots和 ELISA结果也表明屡次被携带Wolbachia的蚊虫叮咬的人类会产生对抗蚊虫成分的抗体，但没有产生对抗该菌的IgG抗体，这表明该菌抗原在蚊虫叮咬时并没有感染人类，也没有引起人类宿主的免疫应答［20］。

2.2Wolbachia对环境或者生物链影响 人们也担心Wolbachia是否会通过水平传播影响环境或者生物链。Wolbachia没有感染性，而且必须得通过母系垂直传播。研究发现，当宿主死去时，该菌将和宿主尸体一起降解，并对尸体周围的植物叶、根和土壤进行检测，均没有发现该菌可以体外寄生［20］。自然界中每天均有大量感染Wolbachia的昆虫死去，但在外部环境并无发现该菌独立存在。Wolbachia通过显微注射可以进行种间转染，但这并不意味着该菌可以通过水平传播感染其他物种，或者说这种水平传播只存在一种非常低的概率事件中。人工转染的过程，其实是Wolbachia在体外经过多代组织培养，已经达到对该组织的预适应性，从而才可以在新的宿主体内稳定存在，且研究发现在适应过程中该菌株有大量的基因突变，但或许这对蚊虫能够感染该菌是存在着重要的意义［22］。自然界中，蚊虫可作为大多数昆虫的食物，那通过食用携带Wolbachia的蚊虫是否会导致捕食者感染该菌。研究发现，对没有携带Wolbachia的蜘蛛喂养感染该菌的蚊虫，随后对蜘蛛体内各个组织进行检测，并没有发现Wolbachia的感染，说明该菌并不会通过自然界中的生物链而感染其他物种［20］。

3 存在问题与展望

共生菌Wolbachia无论在实验室［11］还是在初步野外试验［4］的过程中都显示出非常巨大的潜在优势，取得的效果也是非常不错。该菌通过自身与宿主的相互作用，使其能够快速入侵野生种群，或压制种群数量［3］，或对大部分RNA病毒复制有干扰作用［12－14］，且对人类、动物、环境和生物链等均没有影响［20］。然而对于Wolbachia的实际运用仍存在着一些问题，蚊虫Wolbachia的野外试验主要存在着安全性和其散播的可能性，虽然大量的实验数据已表明该菌对人类、动物、环境和生物链是安全的，同样，实验的结果需要长时间和广阔的地理区域才检测到可能发生的后果，而评估这些实验结果又将是一项艰巨的任务。许多关于长期后果的问题只有在开展放养蚊虫活动后才可以评估，如像病毒对Wolbachia产生的基因变异，或经过Wolbachia不断垂直传播后是否仍有足够的能力抑制病毒，或由于环境问题影响而引起蚊虫自身的变化等，这些都是长期存在的科学问题，要解决这些问题将是一个艰巨的挑战［20］。Wolbachia作为一种生物制剂，已经表现出巨大的潜在优势，不仅仅是可以控制蚊媒病的传播，而且由于自然界中大部分昆虫均有携带Wolbachia，因此甚至可以利用该菌应用到防治其他领域中的害虫，如农业害虫，这将又是一个重大突破。

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