基因治疗肌腱韧带损伤的研究进展*

张国荣 张玫琦 胡金秋

肌腱韧带再生能力较差，损伤后常由瘢痕组织代替，很难恢复其正常特性。传统治疗方法疗效有限，基因治疗作为一种生物医学新技术越来越受到研究者的青睐。笔者就肌腱韧带损伤修复相关因子、基因治疗方法与应用前景作一简要综述。

1 肌腱韧带的结构与损伤修复

肌腱与韧带的结构大致相同，主要由致密结缔组织构成。大量密集的胶原纤维顺着受力方向平行排列成束。腱细胞很少，只占其体积的5%左右，散在分布于纤维之间。胶原纤维占组织干重的60%～85%，化学成分主要是胶原蛋白，其中以Ⅰ型为主，Ⅲ型和Ⅴ型含量较少。此外还含有少量弹性蛋白和蛋白聚糖[1]。这些基质由腱细胞分泌并调节胶原纤维的聚合。

年龄增长、运动过度、外伤均可造成肌腱损伤。在美国每年约有20万人患韧带肌腱损伤疾病[2]。损伤肌腱的修复可以分为3个阶段[3]：（1）炎性反应：受损部位首先会出现血肿，炎性细胞聚集并释放炎性因子，血管生成因子启动血管生成。（2）细胞增殖、纤维组织形成：随后炎性细胞逐渐减少，成纤维细胞开始合成胶原纤维等细胞外基质，这一过程持续数周。（3）重塑与成熟：合成的胶原纤维沿肌腱长轴方向进行组装排列，逐渐填充修复受损部位，这一过程持续1年以上。经过自然修复过程，损伤肌腱在结构与功能上能够获得一定程度的修复，但与正常组织相比，其微观结构改变，力学性能低下，易造成重复断裂。目前，对于肌腱韧带损伤的治疗主要是移植修复，移植的材料包括自体肌腱、同种异体肌腱和人工合成肌腱，这些方法有很多局限且效果不佳[4-5]。基因治疗作为一种生物医学新技术越来越受到肌腱韧带损伤研究者的重视[6]。

2 与肌腱韧带损伤修复有关的生长因子

当肌腱韧带损伤后，很多生长因子能够释放到损伤部位促进细胞增殖、分化和细胞间质的分泌。如成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板相关生长因子BB（PDGF-BB）、胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）和生长分化因子（GDF）。有研究表明，在大鼠髌韧带损伤部位注射重组的FGF，能够促进Ⅲ型胶原分泌和细胞增殖[7]。PDGF-BB能够改善损伤肌腱修复后的力学性能[8]。但一次给药可能造成局部PDGF-BB过高，定时多次给药可以获得较好效果[9]。IGF-1有抗炎和诱导上皮细胞生成的作用[10]。PDGF-BB、IGF-1和EGF都能够促进成纤维细胞增殖。有研究表明，TGF-b1能够促进胶原纤维生成。与EGF联合应用可以显著提高其治疗效果[8]。在胚胎发育时期，鸡肢体远侧肌腱的生成也与其有关[11]。TGFb家族的调节因子Smad8也能够促进肌腱生成[12]。同时，GDF-5、6、7也与肌腱的形成有关。抑制大鼠的GDF-5、6基因表达能够引起肌腱生长障碍[13-15]。在肌肉或皮下异位注射GDF-5、6、7可以促进肌腱样组织生成。总之，很多生长因子都影响肌腱的形成与损伤修复，但是给药时间、方式与剂量还需进一步优化。

3 与肌腱韧带损伤修复有关的细胞间质

研究表明，肌腱韧带的很多细胞间质也参与其损伤修复。Ⅴ型胶原与核心蛋白聚糖（decorin）在正常肌腱韧带中含量较少，但参与并影响Ⅰ型胶原的聚合过程[16]。体外研究发现过多的Ⅴ型胶原和decorin抑制了Ⅰ型胶原纤维的生长自聚。体内动物实验发现Ⅴ型胶原在损伤肌腱中持续高表达52周。decorin的表达也有所升高。同时损伤肌腱的胶原纤维直径明显变小。培养抑制了Ⅴ型胶原功能的纤维细胞（Ehlers-Danlos Syndrome），其所产生的Ⅰ型胶原纤维直径大于正常胶原纤维[17]。这些研究显示Ⅴ型胶原和decorin的多少或功能强弱直接影响Ⅰ型胶原纤维的直径大小。而这些小直径胶原纤维可能是导致损伤肌腱修复后力学性能低下的原因[18]。所以抑制损伤肌腱中Ⅴ型胶原和decorin的高表达可能有利于促进大直径胶原纤维的生成，提高损伤肌腱的修复效果。本研究组，通过培养体外组织工程肌腱，利用siRNA技术不同程度地抑制Ⅴ型胶原的表达，已经获得了含有较大直径胶原纤维的人工肌腱[19-20]。

4 基因载体的种类与特性

如前所述，很多生长因子和细胞间质参与肌腱韧带的损伤修复。如何调控这些基因的表达，提高肌腱韧带的修复效果是研究热点。有治疗作用的蛋白质可以通过重组DNA技术获得，但由于其半衰期较短，往往需要反复注射才能达到治疗效果。所以利用基因调控技术，提高或降低靶细胞中某些基因的表达，从而调节内源性蛋白质的合成与分泌，促进肌腱韧带损伤修复是一种更为可行的治疗手段。

为了改变靶细胞中基因的表达，需将目的序列（DNA、反义核酸或siRNA等）包在载体中，由载体将其带入靶细胞。DNA可以作为靶细胞中独立的遗传物质或与其染色体进行整合，被转录并翻译出有治疗作用的蛋白质。反义核酸、siRNA等则可以干扰某些基因，降低在肌腱损伤过程中过表达的蛋白质分子。基因载体分为非病毒载体和病毒载体[21-23]。非病毒载体有DNA基因枪、脂质体等。他们毒性较小，操作简单，很少产生免疫排斥反应，但转染能力较差，传递基因的效率不高。病毒载体常用的有腺病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒等，它们传递基因的效率较高，且能够持续稳定地表达所需的蛋白质。但易产生免疫排斥反应，其安全性也有待进一步控制和完善。当前，病毒载体较多地应用于各项基因治疗研究中。脂质体等也广泛应用于转移反义核酸和siRNA分子等[24]。

5 基因治疗的优缺点

基因治疗有其自身的优越性也存在较高风险。其优点主要有：（1）通过调节内源性基因表达，可以在根本上治疗某些基因缺陷疾病；（2）内源性合成的蛋白比外源性重组蛋白生物活性更高；（3）可以在局部达到较高产物浓度，并持续较长时间。基因治疗的缺点是其安全性有待完善和尚不能灵活控制。如携带基因的病毒是否会复制与活化；插入的基因是否会发生突变，造成细胞生长紊乱；目的蛋白过度表达或不稳定表达也有可能发生[25]。当然这种表达不稳定也可能会对治疗有利。科学家们正在研究一种特殊的启动子，可以调节植入基因的启动与关闭，以便灵活控制基因表达。

基因治疗是目前肌腱韧带损伤的研究热点之一。在人体运动系统中，有研究者将IGF-l、TGF-b、BMP-2等基因转移到肌肉、骨组织中产生了积极的治疗效果。对于肌腱韧带损伤，人们已经获得一些能够改善或影响其修复的基因信息，最大的障碍是获得安全有效的基因载体，可以灵活地调控目的基因的表达，并维持其稳定性和安全性。总之，基因治疗肌腱韧带损伤的广阔前景还需研究者进一步探索和研究。

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