肉牛冻精细管无伤害制作技术

林 清，田万强，雷初朝，曹 晖，汤怀斌，昝林森，陈 宏＊

1 种公牛饲养管理

公牛是养在牛舍的单间，还有一个32m2的运动场。牛舍建得较高，上面有气流通道，下层有通风口，牛床保持柔软垫草30cm，并保持干燥，这样可使舍内小气候冬暖夏凉。冬季，密闭的牛舍可通过排气孔换气。成年采精公牛一般不需饲养人员牵引运动。用电动转盘每天运动一次，每次1h，以保证使用后能顺利采精。

通过全价饲养控制公牛膘情，以生产出活力好的精液成年公牛每天喂干草13kg、精料3kg、大蒜风干片30g、含蒜20% 的大蒜草粉100g、矿物质添加剂50g、海藻粉100g。

每千克公牛用矿物质添加剂含维生素A、D330万和60万国际单位，维生素E、K3、B1分别为200、150、300mg。酵母50g、海藻100g、食盐50g、镁6.03g。铁2.01g、锌1.14g、锰1.06g、铜0.51g、钻24mg、磷19.98g，钙287.87g。

保持种公牛健康无病，每年经过两次检疫达到合格标准。每天保证运动量在2h以上。采精期间每天补充鸡蛋5～8个，红萝卜500g以上。采精频度以每周2次为宜，每次采精时间间隔30min为宜。

2 采精及冻精细管制作

2.1 采精前的准备

2.1.1 公牛和胎畜 提前准备好采精胎畜（以发青母牛为好），清理胎畜后躯污物。种公牛采精前用消毒液清洗下身污物。剪去包皮周围长毛。使这一区域保持干净无污染。

2.1.2 采精设备的清洗和消毒 采精设备中凡是与精液直接接触的内胎（光面）、积精管、温度计、玻璃棒、镊子等先用清水加清洗剂清洗干净，再用蒸馏水清洗三遍，以内胎上面不挂水珠，并有一层水膜均匀附着在上面为好。清洗干净后晾干，然后再用75%酒精棉球整体擦洗三遍，注意不要有遗漏地方。这项工作需要在采精前12h完成。

2.1.3 采精设备安装 安装人员在安装前简短指甲，并磨光。然后清洗手臂，再用75%酒精棉球消毒手臂。最后再安装采精器。注意安装内胎以平滑无皱褶为好。

2.1.4 采精场地 采精场地保持干净卫生，必要时场地每周消毒一次。采精辅助人员保持自身安全，保持采精场地、安静、干净，采精过程中不要大声喧哗。

2.2 采精过程

采精人员在胎畜和种公牛到位后，需在尽短时间内调整好采精器温度38～42℃。润滑剂（凡士林）以内胎前1／3～1／2均匀涂抹，不宜过多。压力保持适中。等种公牛爬跨后迅速将公牛阴茎导入假阴道内。等公牛射精后，应多停留几秒时间等精液完全流进积精瓶，切勿立刻退出。注意一定要使积精管内温度保持在35℃。

2.3 采精后检查

检查采精量，检查活力、密度、pH值等各项指标，并及时做好记录。

2.4 稀释液的配制

在采精的同时制备稀释液配方：基液：乳糖2.5 g、柠檬酸钠1.4g、葡萄糖1.2g、果糖0.5g，以上各物溶于100mL蒸馏水（双蒸水）中，充分混合均匀。然后高压灭菌15min。

A液：基液80mL＋20mL新鲜卵黄，再加青霉素16万单位 链霉素10万单位，然后采用磁力搅拌器搅拌，搅拌时间至少20min，混合均匀。

B液：A液93mL＋7mL甘油，混合均匀。

2.5 稀释过程

第一次稀释：按照检查结果确定稀释倍数，原精液与A液缓慢稀释，并均匀混合，稀释到最后稀释倍数的一半。这一过程可以在36℃条件下进行。

由36℃条件转入4℃条件也需要缓慢进行。这一过程需要1.5h以上。

第二次稀释：按照检查结果确定稀释倍数，第一次稀释后的精液与B液缓慢滴注，稀释到最后稀释倍数。

2.6 平衡过程

使稀释后的精液温度保持4～5℃环境下，平衡2～4h。然后再次活力检查。

2.7 分装和封口

平衡后符合质量的精液在2～4h内进行分装，每支细管0.25mL。保持封口端精液距离细管末端1cm为宜。再用长柄镊子在酒精灯上适度考热封口。这一过程在4℃条件下进行。

2.8 冷冻过程

熏蒸法：将分装好的细管平铺在自制的网筛上，立即搁置在盛液氮容的泡沫箱内，加盖进行熏蒸，初冻温度在－100～－130℃ 之间，熏蒸7～8min，然后降温至－160℃ ，再熏蒸4～5min。最后收集在细管袋中，液氮保存。注意标记种公牛号，制作时间，解冻方法等。

2.9 保存和检查

制作好的细管冻精可长期保存在液氮灌内，定期检查并及时加注液氮，20d或一个月抽样检查一次冻精活力。如有质量问题及时查找原因，并及时纠正。

3 活力检查

3.1 细管冻精生产的质量标准

1）解冻后精子活力不低于0.3（十级评定法）。

2）每支细管的精子数量不低于1 500万个。

3）解冻后精子畸形率不高于2%。

4）解冻后精子存活时间在37℃下不低于4 h。

3.2 解冻及检查

用36℃温水快速解冻进行3～5s，并不停摇动。精液质量检查项目为活力、畸形精子率、存活时间。随机抽样5支，按最佳温区解冻后，涂片放在保温38℃显微镜下观察。活力在0.3～0.65为合格，0.3以下为不合格。我们对制作的325支细管冻精进行了活力检查，平均活力达到0.6以上。

3.3 活力检测结果

我们对这种方法制作的1 200支细管冻精进行了50支抽检，活力均在0.4～0.5之间。说明这种方法在实践中是切实可行的，尤其对冻精活力有较大提高。