异丁苯丙酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用

汪巧云余 智

（1 浙江省淳安县第二人民医院药剂科，浙江 淳安 311719；2 广西桂林医学院附属医院神经内科，广西 桂林 541001）

异丁苯丙酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用

汪巧云1余 智2

（1 浙江省淳安县第二人民医院药剂科，浙江 淳安 311719；2 广西桂林医学院附属医院神经内科，广西 桂林 541001）

目的探讨异丁苯丙酸在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制。方法通过线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注损伤模型，将48只SD大鼠随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、异丁苯丙酸组(C组)，每组16只。于术前3d分别给予相应处理，缺血120min再灌注24h后评价大鼠神经功能缺损程度，ELISA法测定大鼠脑组织中IFN-γ含量水平，尼氏染色检测大鼠神经元数。结果与A组相比，其余2组神经功能评分、IFN-γ含量水平均明显升高，健存神经元细胞数明显减少(P＜0.05)；与B组相比，C组神经功能评分及IFN-γ含量水平显著降低，健存神经元细胞数明显增多(P＜0.05)。结论异丁苯丙酸可能通过减少IFN-γ的释放，增加健存神经元数，从而对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。

异丁苯丙酸；脑缺血/再灌注；炎症反应；神经保护

早已观察到炎性反应与脑缺血再灌注损伤的关系越来越受关注[1]。目前，关于非甾体抗炎药对缺血性脑损伤的作用还不十分清楚。本实验采取非甾体抗炎药异丁苯丙酸，观察其对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中炎性反应、健存神经元细胞数的影响，进一步探讨异丁苯丙酸神经保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠（浙江中医药大学实验动物中心提供，SPF级）；异丁苯丙酸购自中美天津史克制药有限公司；IFN-γELISA试剂盒（R&D Systems公司，美国）；甲苯胺蓝 （Promega公司）；Labo fuge 400R高速低温离心机（Heraeus公司，德国），酶标仪（BioTek 公司，美国），电子显微镜（OLYMPUS，日本）等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药

将48只大鼠（体质量240～280g），按随机数字表法分为5组（n=16），术前12h禁食，饮水自由。①假手术组（A组）：术前3d，1次/d，每次灌胃生理盐水4mL/kg；②模型组（B组）：缺血前3d，1次/d，每次灌胃生理盐水4mL/kg；③异丁苯丙酸组（C组）：缺血前3d，1次/d，每次灌胃异丁苯丙酸8mg/kg（溶于蒸馏水 浓度为4%）。

1.2.2 局灶性脑缺血再灌注模型的建立

采用改良的Zea- longa[2]法制备中动脉阻断（MCAO）模型：经腹腔注射10%水合氯醛（0.3mL/kg），取颈部左旁正中切口，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）及颈内动脉（ICA），结扎并游离ECA的近端，将蛙心夹夹闭CCA和ICA后在ECA游离段上剪开小口将制备好的尼龙线栓经CCA分支处通过ICA入颅，线栓深度为18～19mm。缺血120min后抽出线栓即可造成再灌注模型。模型成功标志：苏醒后出现左侧Horner综合征；提尾悬拉后出现右上肢蜷缩屈曲；爬行时向右侧转圈或跌倒。A组大鼠在术中分离左侧CCA、ECA及ICA，但不做任何缺血处理。

1.3 指标评价

1.3.1 神经功能评分

再灌注24h后，各组大鼠按Zea-longa5分法进行神经功能评分，标准如下：①无神经功能缺失症状，计0分；②不能伸展右侧前肢，计1分；③爬行时向右侧转圈，计2分；④身体向右侧倾倒，计3分；⑤不能自发爬行、意识障碍，计4分。

1.3.2 IFN-γ含量水平测定

再灌注24h后，随机抽取各组8只大鼠，迅速断头取脑。于冰上距额叶前端3mm和9mm处进行冠状分离，取中间6mm厚的脑组织块，然后沿此脑块矢状缝两侧约2mm处，从上至下切除两侧半球的正中结构，将左侧脑块作为检测标本。严格按ELISA试剂盒检测要求进行操作。

1.3.3 尼氏染色

严格按照试剂盒检测步骤进行操作。在光镜（X400）下观察健存神经元的数量，计算尼氏小体的数目/相应的面积并采图。

1.4 统计学处理

应用SPSS17.0软件进行统计分析。神经功能评分用中位数/四分位数法表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi检验。多组计量资料用χ—±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经功能评分

A组各大鼠无神经行为功能障碍，评分（0.0，0.0）明显低于其余2组，差异有统计学意义（H=60.018，P＜0.05）；与B组评分（2.0，3.0）相比，经异丁苯丙酸预处理的C组大鼠神经功能评分（1.0，2.0）明显降低，差异也有统计学意义（t=8.96，P＜0.01）。

2.2 干扰素-γ含量水平测定

A组缺血侧大鼠脑组织中IFN-γ含量水平（2.46±0.57pg/mg）均明显低于其余2组，差异有统计学意义（F=11.205，P＜0.05）；与B组（3.81±0.19pg/mg）相比较，经异丁苯丙酸预处理的C组大鼠IFN-γ含量水平（3.07±0.67pg/mg）均显著降低，差异同样有统计学意义（t=11.73，P＜0.05）。

2.3 尼氏染色的比较

A组缺血侧顶叶皮层脑组织尼氏小体多且体积大，呈紫色分布于核周围（9.89±0.81%），与其余2组大鼠相比差异均有统计学意义（F=116.64，P＜0.01）。B组尼氏小体数量明显减少，少量存在的尼氏体也变小或变形（3.65±0.98%），而经异丁苯丙酸预处理的C组相应区域尼氏体数量较多且变形较少（7.77±0.51%），两组相比差异也有统计学意义（t=8.39，P＜0.01）。

3 讨 论

目前认为，脑缺血再灌注时受血流变学和缺血缺氧的改变引起神经细胞释放大量炎症信号，促进炎性细胞的聚集和炎性因子的释放[3]，导致缺血损伤区炎性细胞浸润，进而加速神经细胞的坏死和凋亡，炎性细胞的浸润与炎症反应的其他要素如转录因子、信号传导分子和黏附分子密切相关。

有研究报道IFN-γ可通过活化P38激酶，诱导细胞因子及Ⅱ类组织相容性复合体（MHC）的表达，共同参与细胞的增殖、分化或凋亡。本研究也发现模型组IFN-γ含量水平相比假手术组显著升高，健存神经元数较假手术组明显降低，与Xu 等的研究报道基本相一致，由此我们推测IFN-γ在脑缺血再灌注损伤后形成细胞损伤时发挥至关重要的作用。

以往在治疗和预防脑缺血时仅考虑到非甾族抗炎药，如阿司匹林的抗血小板聚集作用，而忽略了其抗炎作用。本实验表明，异丁苯丙酸能明显增加局灶脑缺血周边神经细胞的生存数量。异丁苯丙酸具有较强的抗血小板集聚作用并且能抑制血栓烷的释放，但此可能不是减轻缺血性脑损伤的机理，因为其他有此作用的抗炎药，如阿司匹林、消炎痛等并不能防止急性缺血性心肌损害的发展。异丁苯丙酸可稳定溶酶体膜，其他抗炎药则无此作用。这种生物膜稳定作用能防止或减少水解酶的释放，后者能使细胞自溶加重细胞膜损害。在缺血/再灌注损伤中，炎性细胞浸润对缺血部位的损害作用有:增加耗氧量；产生大量自由基；填塞微血管和释放水解酶等。研究证实异丁苯丙酸可通过抑制炎性细胞减小脑缺血损害范围。本实验结果也证实，经异丁苯丙酸预处理后的大鼠神经功能缺损较模型组明显改善，IFN-γ的含量水平显著降低，并且缺血半暗带的顶叶皮质中健存的神经元数量显著增多，由此推测异丁苯丙酸可减少促炎介质（IFN-γ）的含量水平。异丁苯丙酸口服吸收快，用药后1h血液浓度达高峰，可在有限的脑缺血治疗窗内起作用，此点有实际的临床意义。

由此可见，吡格列酮可通过减少促炎介质（IFN-γ）的释放，减轻了大鼠缺血再灌注后的损伤，从而很好的增加健存神经元，为该药在缺血性脑血管疾病的临床使用提供一定的理论依据。

[1] Nakka VP,Gusain A,Mehta SL,et al.Molecular mechanisms of apoptosis in cerebral ischemia: multiple neuroprotective opportunities[J].Mol Neurobiol,2008,37(1):37-38.

[2] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20(1):84-91.

[3] Denes A,Thornton P,Rothwell NJ,et a1.Inflammation and brain injury:acute cerebral ischaemia,peripheral and central inflam mation[J].Brain Behav Immun,2010,24(5):708-723.

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1671-8194（2013）15-0102-02