Aβ1－40诱导的神经干细胞凋亡中钾通道和JNK信号转导通路的作用

田嘉莹 田国忠 熊庆华 李梅秀 盛宝英△

1）佳木斯大学附属第一医院神经三科 佳木斯 154000 2）佳木斯大学 佳木斯 154000 3）佳木斯大学附属第一医院佳木斯 154000

阿尔茨海默病（A1zheimer’s disease，AD）为老年人群中最常见的中枢退行性脑病。AD的特点为β－淀粉样多肽（Aβ）聚集形成的老年斑及神经元减少［1］。那么如何避免脑内Aβ致使神经元减少或者诱发神经干细胞分化为神经元并迁移受损部位进行修复就成为现在最为关注的研究方向之一。现研究证实Aβ诱导的神经元损伤，主要为细胞凋亡。细胞凋亡过程中除基因调控外，可由细胞内的离子稳态尤其是钾离子的稳态调控。本实验将探讨钾通道阻滞剂（tetraethy－1ammonium，TEA）作用于 Aβ1－40诱导的神经干细胞凋亡中钾通道的作用；c－Jun 氨基端激酶（c－Jun N－termina1kinases，JNK）信号转导途径在神经干细胞死亡过程中磷酸化的改变及钾通道与JNK的关系，从而进一步了解AD的发病机制。

1 材料与方法

1．1 实验动物、主要试剂及主要仪器 雄性 Wistar大鼠＜24h，由佳木斯大学动物中心提供；四乙胺、MTT、SP600125、Hoechst33342（Sigma公司）；Aβ1－40（Biosouxee公司）；Caspase分析试剂盒（美国Promega公司）；二抗（进口分装）；Nestin（北京博奥森生物技术有限公司）；DAB试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；Actin多克隆抗体（Santa cruz公司）；10－200 kDa蛋白质标准（Fermentas）。酶标计数仪E1X800（Bio－TEK公司）；IBE2003倒置荧光显微镜（重庆光学仪器厂）。

1．2 大鼠海马区神经干细胞的分离与传代培养及鉴定 新生的 Wistar大鼠（＜24h），取海马组织，用 Hank’s液进行漂洗，将组织剪成1mm3左右的小块加入培养液（DMEM／F12 1：1，2%B27，bFGF 20μg／L，表皮生长因子20μg／L）5 mL，制成单细胞悬液，调整一定浓度后接种于培养瓶中，将其放入5%CO2培养箱中，每3d换半量培养液一次，每7d传代一次。取传代稳定的神经干细胞行Nestin细胞免疫化学检测。

1．3 实验分组 实验一共分4组：Aβ1－40组：将传三代后的神经干细胞加入 Aβ1－405μm；Aβ1－40＋TEA组：在 Aβ1－405μm孵育前30min加入TEA 5mm；TEA对照组：神经干细胞加入TEA 5mm；空白对照组：加入等量的培养液的神经干细胞培养组。上述各组分别在0h、12h、24h和48h各时间点行细胞活性及凋亡检测。

实验二共分4组：Aβ1－40组：在传三代后的神经干细胞加入 Aβ1－405μm；Aβ1－40＋SP600125组：在 Aβ1－405μm 孵育前30 min加入SP 600125 10μm；SP对照组：神经干细胞加入SP600125 10μm；空白对照组：加入等量的培养液的神经干细胞培养组。上述各组分别在0h、12h、24h和48h各时间点行细胞活性及凋亡检测。

1．4 MTT法 将 MTT溶液（5mg／mL）20μL加入细胞中，放置37℃培养箱，将96孔板内的培养基弃去，加入溶解液DMSO 150μL，振荡10min使其充分溶解结晶产物。在酶标仪上以波长490nm检测每孔的OD值。每组设3个孔，实验重复3次，细胞存活率的计算：细胞存活率＝试验组光吸收值／对照组光吸收值×100%。

1．5 Hoechst33342法 将Hoechst33342加入各组细胞中，37℃培养箱30min。加入4%多聚甲醛与培养液以1：3混合，固定细胞10min。固定好后，将细胞悬液涂在载玻片上加盖玻片。荧光显微镜下在紫外（UV滤光片）激发下观察结果。随机选取10个视野统计每个视野中的阳性细胞数，至少重复3次，计算细胞凋亡发生率。

1．6 比色法 用PBS在细胞表面漂洗2次，收集到EPPendoff管内，450×g 4℃离心10min收集细胞。放于冰上，用冰冷的PBS漂洗一次，然后悬浮在100μL细胞裂解缓冲液中。以液氮－常温的方式裂解细胞，然后在冰上孵育15 min。15000×g 4℃离心20min后收集上清液。用Bradford方法测蛋白的浓度。按试剂盒依次在96孔板内依次加样。加2μL DEVD－pNA 底 物 （10mm）到 96 孔 板 内。用parafi1m封口膜将板子封严，37℃孵育4h。在405nm测量吸光度，计算Caspase－3特异性活性。

1．7 Western b1ot方法 将细胞在冰上去除培养液，PBS洗一次，每孔加入含PMSF的细胞裂解液50μL，冰上孵育30min，刮取细胞移入EP管中，4℃12 000rpm离心5min，吸取上清液转移入EP管－70℃保存。用细胞蛋白总浓度测定试剂盒测出每个蛋白标本的蛋白质浓度，加入1oading buffer。配胶，上样，电泳，半干转膜，封闭，一抗孵育过夜，PBST洗膜，加二抗，摇床摇1h，PBST洗膜，加发光液发光，image J软件分析。

2 结果

2．1 神经干细胞培养及Nestin抗原表达 新生大鼠分离海马区的单个神经干细胞3d后呈透亮的圆形，传代培养至第三代可见培养液中形成较大的神经球，神经干细胞标记性蛋白Nestin的表达呈阳性。

2．2 TEA对 Aβ1－40诱导的神经干细胞存活率、凋亡率及caspase－3活性的影响

2．2．1 TEA对 Aβ1－40诱导的神经干细胞的存活率的影响：Aβ1－40组神经干细胞在不同的时间点，细胞存活明显减少（P＜0．05），且随时间延长细胞存活率下降（P＜0．05）。Aβ1－40＋TEA组较 Aβ1－40组细胞存活率明显增加（P＜0．05），而空白对照组和TEA对照组神经干细胞存活率无明显改变（P＞0．05）。

2．2．2 TEA对 Aβ1－40诱导的神经干细胞凋亡的影响：荧光镜下与空白对组相比Aβ1－40组神经干细胞48h后出现部分细胞核呈浓染的碎块状，典型的凋亡形态学改变，凋亡率（20．3±0．6）%，（P＜0．01）。Aβ1－40＋TEA 组较 Aβ1－40组细胞凋亡形态学变化少，凋亡发生率明显下降（11．6±0．4）%，差异具有显著性（P＜0．01）。

2．2．3 TEA对 Aβ1－40诱导的神经干细胞 Caspase－3活性的影响：Aβ1－40＋TEA 组在各时间点均可降低 Caspase－3的表达（P＜0．05），特别在24h这种趋势更为明显（P＜0．01），而空白对照组和TEA对照组在各时间点Caspase－3特异性活性未发生明显改变。

2．3 JNK及JNK的选择性阻断剂SP600125对 Aβ1－40诱导神经干细胞磷酸化的影响

2．3．1 β1－40诱导神经干细胞的JNK磷酸化的表达：神经干细胞经Aβ1－405μm孵育48h，不同时间点JNK的磷酸化均有表达。JNK磷酸化水平随着时间的延长也逐渐增加，在24h达到高峰（P＜0．01）。并且JNK的阻断剂SP600125可显著阻断这种激活。

2．3．2 SP600125对 Aβ1－40诱导的神经干细胞的存活率影响：Aβ1－40＋ SP600125组与 A1－40组相比可明显减轻神经干细胞凋亡，使神经干细胞的存活率从（72．7±3．2）%、（50．35±2．7）%、（42．7±7．3）%分别增加到（92．6±0．70）%，（76．1±0．73）%、（67．0±0．64）%，P＜0．01。

2．3．3 SP600125对 Aβ1－40诱导的神经干细胞凋亡的情况：Aβ1－40＋SP600125组可明显降低5μm Aβ1－40孵育引起的神经干细胞的凋亡的发生，SP600125使凋亡发生率从（0．3±0．6）%降至（9．6±1．3）%（P＜0．01）。而SP600125组无明显变化，说明SP600 125本身不影响细胞的凋亡。

2．3．4 SP600125对 Aβ1－40诱导的神经干细胞 Caspase－3活性的变化：在检查JNK阻断剂SP600125的作用时，Aβ1－40＋SP600125组可显著减少 Caspase－3的激活，从 Aβ1－40组的（12．46±0．47）pmo1／（h·μg）下降到（5．09±0．40）pmo1／（h·μg）（n＝3，P＜0．01）。

2．4 TEA对Aβ1－40诱导的神经干细胞JNK磷酸化表达的影响 Aβ1－40＋TEA组较 Aβ1－40组JNK磷酸化表达显著降低（P＜0．01）。而空白对照组和TEA组神经干细胞JNK磷酸化表达无明显改变（P＞0．05）。

3 讨论

AD是与衰老相关，以严重的高级认知功能障碍为特征的隐袭性退行性脑病，其发病机制至今未明［2－3］。病理学特点为Aβ聚集成老年斑和神经纤维缠结形成及神经元减少［4－5］，其中Aβ聚集造成细胞凋亡是AD发病的关键因素之一。

在成年哺乳动物正常脑组织中海马齿状回的颗粒下层及侧脑室壁的脑室下层存在神经干细胞聚集，这些细胞增生活跃，特别在缺血缺氧情况下神经元损伤及丢失可刺激这些区域神经干细胞的增殖和分化并对其进行补充。研究表明，AD患者补充“救活”机制却没有发生，表现为神经元持续性的缺失。本实验研究发现，经Aβ1－40孵育后神经干细胞增殖减速，凋亡增多，且发育不良，这可能是神经干细胞无法分化成相应神经元，而导致神经元缺失增多的原因。

细胞凋亡不仅可由基因调控，也可由细胞内的离子稳态尤其是K＋的稳态调控。研究证实，心肌细胞凋亡中钾通道被异常激活，K＋外向电流增加。同样胆碱能干细胞株SN 56神经元与Aβ共培养也得到相同的结果［6－7］。本实验研究发现，Aβ1－40与神经干细胞共孵育时，细胞发生凋亡。钾通道阻滞剂TEA可以明显减轻Aβ1－40诱导的神经干细胞死亡，使神经干细胞的存活率升高，凋亡的发生率明显下降，从而推测在Aβ1－40诱导的神经干细胞凋亡时激活了钾通道。本研究通过应用TEA，在Aβ1－40诱导的神经干细胞凋亡模型中进一步检测了凋亡相关蛋白的改变与钾通道之间的关系。

Caspases是哺乳动物细胞凋亡的主要相关蛋白酶家族。凋亡信号起动 Caspase－3的活化［8］，活化的 Caspase－3作用于底物蛋白，促进底物分解，引起凋亡［9］。因此，通过检测Caspase－3的活性大小即可了解细胞凋亡的变化。实验中我们在 Aβ1－40孵育前加入 TEA 5mm 预处 理 30min，结果Caspase－3的活性被明显抑制了，说明发生凋亡的过程中，钾通道的激活上调，先于Caspase－3的激活。TEA有望成为治疗AD的药物作用靶点。但是钾通道介导凋亡的信号转导通路尚不明确。

丝裂原激活蛋白激酶 （MAPK）是细胞凋亡的一条重要的信号转导途径，其中JNK和p38激酶信号转导通路可促进细胞凋亡。本实验利用Western b1ot方法检测神经干细胞经Aβ1－40孵育后，JNK磷酸化水平，结果不同时间点JNK的磷酸化均有表达。JNK磷酸化水平随着时间的延长也逐渐增加，并且JNK的阻断剂SP600125可显著阻断这种激活。JNK特异性阻断剂SP600125可抑制Aβ1－40诱导的神经干细胞相亡，对Aβ1－40诱导的神经干细胞毒性具有明显的保护作用。研究证实，Aβ诱导的神经细胞凋亡中，无论是体内还是体外实验，均有 Caspase－3的激活［10－11］。本研究进一步证实Aβ1－40诱导的神经干细胞凋亡中Caspase－3的活性增加，且SP600125可以抑制Caspase－3的激活。说明JNK通路发生在Caspasc－3激活的上游。验证JNK信号转导途径在Aβ1－40诱导的神经干细胞损伤中具有重要的作用。

钾通道激活和JNK的磷酸化二者之间是否有联系？本研究应用TEA作用于Aβ1－40诱导的神经干细胞检测JNK磷酸化水平的变化，结果JNK磷酸化表达在各时间点均显著降低。说明Aβ1－40引起的钾通道激活和JNK磷酸化两者之间有一定的相互联系，进而诱发了下游凋亡相关蛋白的改变。通过对AD发病机制的研究为神经干细胞凋亡的早期调控提供有益的补充，为进一步开发治疗AD药物提供新的思路和方法。

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