内皮祖细胞治疗缺血性脑血管病的最新研究进展

胡新星综述，秦 超审校

内皮祖细胞治疗缺血性脑血管病的最新研究进展

胡新星综述，秦 超审校

脑血管病以其高发病率、高死亡率、高致残率对人类生命健康构成了重大威胁。我国每年新发脑卒中患者约200万人，其中缺血性脑卒中占70%［1］。动脉粥样硬化所致血管狭窄是导致其发生的主要原因，尽早开通闭塞的血管对急性卒中患者尤为重要。阿替普酶(rt－PA)溶栓具有明显的时间窗(3h或4.5h)，且并发出血风险大。经皮腔内血管成形术(PTAS)为有创治疗，风险大费用高且再次狭窄率高。尽管大量的动物实验证实神经保护剂对于缺血性卒中疗效可观，但临床实验却不尽如人意［2］。新的研究表明干/祖细胞能加速脑卒中患者血管再通、降低卒中风险、促进康复，因此目前被认为在脑卒中治疗领域具有极大的潜能。

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)源于外周血的单核细胞或者骨髓组织，可以在体外培养，它们在细胞表面同时表达造血干细胞和内皮细胞标记分子［3，4］。由于EPCs具有分化为血管内皮细胞和分泌保护性细胞因子及生长因子的能力，因此其被认为具有维持血管内皮完整性、参与内皮的修复和促进出生后血管再生的作用。大量的研究证实EPCs在高血压病、糖尿病、冠心病、脑卒中等疾病中数量明显减少且功能紊乱，其已被作为血管疾病潜在的生物学标志［5，6］。脑卒中为致残、致死的重要原因，然而在其治疗上仍有一定局限性，尤其是在血管再生及神经保护方面。新的证据表明，EPCs的治疗可以为缺血性脑血管病开辟一条新径，目前，静脉输注EPCs治疗缺血性卒中的临床实验正在进行中。本文总结了EPCs的一般概念和特点，并重点强调其在治疗缺血性卒中方面的基本原理、观点及前景。

1 内皮祖细胞的概述

1.1 EPCs的定义、表面标志及基本特征 内皮祖细胞(EPCs)由日本科学家Asahara于1997年首次从人外周血中分离出来，而后研究发现其主要来源于骨髓，是一类具有游走特性的能定向增殖分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞［3，7］。对于EPCs识别的方法主要有3种，分别是集落形成试验、荧光检测及流式细胞术。其原理是针对EPCs表面某些标记物利用抗原抗体反应检测出来。EPCs既具有造血干细胞表面标志(CD34、CD133)，又具有内皮细胞表面标志(CD31、KDR、VEGFR2)，另外CD45、c－kit/CD117、CXCR4及CCR2也能被表达出来。血管EPCs的特异性表面标志目前尚未统一。人们发现，不同组织来源于的EPCs可表达不同的表面标记。如脐带血来源的EPCs(CB－EPCs)表达CD31、CD144、KDR，而骨髓来源的EPCs(BM－EPCs)对于上述标记却不表达或者微量表达，外周血来源的EPCs(PB－EPCs)则表达CD11b、vWF、CD14等［8］。CD34+KDR+抗原组合因其在EPCs表面出现具有高度的特异性和灵敏度，经常被用于EPCs的识别［9］。随着治疗与诊断需求的不断扩大，更多更精准、更理想的EPCs表面标志物将被研究。

基于体外培养特性，EPCs通常被划分为两个不同的细胞亚群。早期EPCs:来源于外周血单核细胞，呈梭形，培养周期短，2～3w达生长高峰，类似于集落生成单位内皮细胞(CFUECs)，研究认为EPCs促进新生血管形成主要是由早期EPCs分泌多种生长因子所致［10］;晚期EPCs:呈鹅卵石样，培养周期相对较长，4～8w达生长高峰，由于晚期EPCs具有较大的扩增潜力，其被认为是真正的干细胞或祖细胞［11］。早、晚期EPCs在体外实验已被证实存在差异，但其再体内的作用及治疗意义仍需进一步验证。

1.2 EPCs的动员及归巢 EPCs是源于骨髓的成体干细胞，它们中的绝大多数在骨髓微环境中呈静止状态，当内外环境变化时，其被动员进入循环血中并分化成内皮细胞。此过程中的机制尚未完全明了。有研究认为基质细胞衍生因子1(SDF－1)、血管内皮生长因子(VEGF)在组织缺氧或损伤的情况下能介导EPCs动员入循环血并迁移至缺血缺氧组织［12］。另一方面，SDF－1与VEGF表达上调可激活基质金属蛋白酶9(MMP－9)，MMP－9不仅促使骨髓EPCs从静态转变为增殖状态，还可以催化膜结合配体转变为溶解性配体，最终促使EPCs动员与归巢［13］。循环EPCs进入受损的血管及缺血组织并执行血管内皮修复及出生后血管再生，此过程意义重大。组织因子及EPCs表面的受体也参与其中，如SDF－1/CXCR4轴在驱使cEPCs向缺血组织归巢中发挥重要作用; CXCR2及其配体、CXCL1和CXCL7动员cEPCs向受损血管处积聚。

1.3 EPCs的功能特征 EPCs具有分化为成熟内皮细胞及分泌多种保护性细胞因子及生长因子的能力，在维持血管内皮的稳定及修复损伤内皮方面发挥重要作用。它同时具有干细胞及内皮细胞的一些特征，不仅能形成克隆集落还能形成新生毛细血管网及产生一氧化氮(NO)，同时还具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白(ac－LDL)和与内皮特异性凝集素结合的能力。相关研究表明循环EPCs的减少是动脉粥样硬化独立的危险因素，并能在粥样硬化斑形成前提前预测，被认为是血管事件潜在的生物学标记［6，9］。在脑血管损伤模型中，人为输注cEPCs能有效抑制血小板激活及斑块形成从而减少梗死灶的发生［5］。

2 EPCs与缺血性卒中

2.1 EPCs治疗卒中的机制 缺血性卒中的发生是一个非常复杂的病理生理过程，包括能量衰竭、细胞内环境的紊乱、细胞因子及自由基介导的毒性作用、炎性细胞浸润和血脑屏障的损坏，它们之间相互联系且相互作用。病理学上，缺血性卒中包括中心的梗死核心区和周围的缺血伴暗带区，核心区为不可逆性损伤，而半暗带区成为目前减少急性梗死面积的靶点区域，积极有效的治疗可将损伤降至最低。

缺血及低氧状态可诱发骨髓动员大量的EPCs参与血管新生，组织缺血时，受损组织局部高浓度表达趋化因子(SDF－1)，由于EPCs表面本身存在趋化因子受体，在SDF－1与CXCR4的作用驱使下大量EPCs动员募集到受损组织，分化并组装形成新生血管网，重新调节缺血组织的血氧浓度。研究表明再生血管网与缺血损伤后的神经保护和神经发生密切相关［14］。EPCs为受损区域的神经提供了富含血管的微环境，新生的血管又为受损的组织提供了富含氧份、细胞因子、离子及充足的血流。此外，神经干细胞沿着这些新生的血管，促使梗死周边区域神经的发生。若血管再生被抑制，将大大降低脑室下区域的神经干细胞向缺血区迁移［15］，将不利于患者神经功能的康复。Minger等［16］用标记神经干/祖细胞的抗体对患者进行检测，发现大量的神经干/祖细胞、血管内皮生长因子阳性细胞及新生血管聚集于梗死灶周围，进一步证实了神经发生、迁移、定居依赖于周边的血管微环境。

2.2 EPCs对卒中的治疗作用 大量的研究证明cEPCs水平在有高血压、高血脂、糖尿病、及动脉硬化等脑血管危险因素的情况下明显降低，cEPCs水平可以作为一个反映血管内皮功能失调、心血管危险因素及脑血管事件的代理指标［5，6，17］。临床研究证实cEPCs水平的高低与急性缺血性卒中的严重程度成反比，卒中后第一周内早期cEPCs水平较高与患者的预后较好独立相关［18，19］。综上，EPCs不仅能作为血管事件的预测指标，同时也为缺血性脑卒中提供了一个新的治疗方向。

如上所述，EPCs在疾病状况下其数量减少，功能紊乱，而人为输注外源性EPCs后能加速受损部位的修复。据报道人为输注CD34+细胞(富含EPC部分)治疗缺血性卒中患者，能有效促进缺血部位新生血管形成及神经生发;也有研究认为人外周血分离出来的集落形成样内皮前体细胞(ECFCs)能减少细胞凋亡，促进血管及神经的形成［14，20］。体外实验证实［5］，在EPCs治疗2型糖尿病小鼠MACO模型中，与对照组相比，实验组梗死区域内血流量明显增多，脑梗死的面积明显减少。近年研究发现［21，22］:标记后的EPCs在输注24h后主要聚集在缺血灶周围的微血管中，并且其能取代损伤处机能失调的内皮细胞。EPCs治疗缺血性卒中的益处主要体现在两方面:(1)在急性缺血早期，人为输注外源性或自身EPCs通过分泌多种生长因子能有效保护因缺血所致的细胞(ECs/神经细胞)损伤或死亡，同时也能募集更多的EPCs，保护神经血管单元及现有的侧枝循环;(2)在缺血晚期，EPCs连同其分泌的生长因子能有效促进血管新生及神经生发，重构微循环及神经元网络，有助于远期的康复。

2.3 EPCs治疗卒中的综合管理 缺血性卒中发生过程中，如何选择合适的时间点输注EPCs，以便将其疗效发挥到最大国内外鲜有报道。有研究认为，基于EPCs强大的再生功能，缺血早期使用有可能使其疗效发挥到最大。然而不容忽视的是卒中急性期常伴随有炎性细胞浸润、自由基及细胞因子的毒性作用，这些很可能限制EPCs的活性及能力［23］。然而Navarro－Sobrino等［24］研究发现源于卒中亚急性期的EPCs能表现出更大的血管再生能力，是否在该期内输注EPCs成效更佳仍有待深入研究。目前认为静脉滴注EPCs为最佳的方式，简单快捷，并发症少;而动脉输注较为复杂，且容易引起血栓形成，导致栓塞;直接将干细胞输注入大脑过程更为复杂，且很可能引起局部出血，风险较大［25］。至于EPCs剂量，在多种动物模型中输注0.2～3×104/gEPCs均显示出了理想的疗效［8，14］。目前用于临床的最理想的EPCs剂量仍在研究中。对于EPCs种类的选择，最近一项研究认为输注晚期EPCs是最佳的选择［14］。然而也有研究显示早期EPCs能到达同样的效果，能减少急性期脑梗死体积及有利于远期的神经功能缺损的恢复［8］，具体如何选择，仍有待于探究。

3 EPCs治疗的安全性、局限性

近年来基于干细胞治疗缺血性卒中的研究报道较多，其治疗的安全性也被广泛探讨。不少研究显示静脉输注自体骨髓干细胞及间充质细胞，在1～5年的随访调查研究中，未发现与治疗相关的异常细胞增长、肿瘤的发生、神经系统渐进性恶化及静脉血栓形成［25，26］。然而也有研究发现循环EPCs在肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等患者中水平增高，BM－EPC存在于肿瘤血管形成的早期，将其消融后可降低肿瘤部位的血管密度，减缓其生长速度［27，28］。这也意味着EPCs可能参与肿瘤内新生血管的形成，应避免对肿瘤患者输注EPCs。此外有报道称EPCs可能加重局部缺血，因其产生的炎症介质如白介素－8、单核细胞趋化蛋白－1可募集炎性细胞浸润，加重缺血部位的炎症反应［14，29］;相反，动物实验发现在急性心梗的小鼠模型中通过输注EPCs可降低局部炎症反应，增加新生血管的密度［30］。也有临床研究表明急性心梗患者输注EPCs治疗未见其对血清C反应蛋白及白细胞水平造成影响，在5年的随访期内也未导致任何肿瘤的发生［26］。目前基于使用EPCs治疗卒中的大规模临床研究正在进行，其安全与否有待于进一步验证。

缺血性脑卒中的危险因素(如年龄、冠心病、高血压、糖尿病、高血脂、吸烟饮酒等)可以削弱外周循环血液EPCs的数量及其血管生成能力［31］。此外，ACEI类、他汀类、阿司匹林等药物也可以影响EPCs的活性和数量。在急性卒中发生时，依靠机体内源性EPCs的代偿修复能力很难形成足够的新生血管网来支持神经功能的恢复，而外源性EPCs又受制于上述因素的影响，加上EPCs获取数量有限，致使目前EPCs临床推广应用存在一定局限性。

4 EPCs的前景与展望

综上所述，EPCs因其独特的内皮、血管再生功能在所有干细胞群体内别具一格，大量的基础、临床研究证实其在治疗缺血性脑血管疾病中发挥非常显著的作用，尽管如此，目前对于EPCs广泛应用于临床仍有许多问题需要解决，如何寻求最佳的EPCs动员途径、如何控制治疗风险、如何将其治疗效益发挥到最大等这些均需要进一步的深入研究。随着EPCs对于缺血性卒中的治疗方面的不断成熟和发展，如何运用EPCs来预防缺血性脑卒中的发生将有可能成为未来另一个研究的方向。

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1003－2754(2013)06－0568－03

R743.3

2013－04－20;

2013－05－28

(广西医科大学第一附属医院神经内科，广西 南宁530021)

秦 超，E－mail:mdqc6639@126.com