VASH对血管新生的调节作用＊

朱江兰(综述)，石 蓓(审校)

(遵义医学院附属医院心血管内科，贵州遵义 563099)

血管新生参与了机体一系列重要的病理生理事件，如发育、生殖、创伤愈合、肿瘤的生长及缺血性视网膜病变等［1］。它是指从原有的血管中长出新的血管的过程［2］，多种血管调节因子参与了这一动态过程，近年来发现一种血管新生抑制蛋白(vasohibin，VASH)也参与了这一过程的调节。VASH有两个同系物，即VASH1及VASH2，两者具有52.5%同源氨基酸序列［3］。但是两者在调节血管新生的时空性及作用却相反。VASH1被认为是一种内皮源性的血管新生负性调节蛋白［4］，而VASH2被认为是一种内皮细胞非固有的且不依赖于VEGF的促血管生成因子［5］。机体所处的状态不同，血管新生发挥的作用也是不同的。如心肌梗塞后促进血管新生可有助于心肌的再生，而对于肿瘤及视网膜血管病变等疾病需要抑制血管新生才能抑制疾病的发展，甚至达到治愈疾病的目的。现就两种不同亚型的VASH调节血管新生的作用进行综述。

1 VASH的基本性质

VASH1最初是在VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endot－ helial cell，HUVECs)基因表达谱DNA微阵列分析试验中发现的［6］。它位于人染色体14q24.3 上［7］，由365 个氨基酸残基构成，在C末端有一簇碱性氨基酸，而这些氨基酸序列中缺乏经典的内质网(endoplasmic reticulum，ER)分泌信号序列，也不与内质网标记物钙粘蛋白共定位［2］，提示VASH1是一个非传统的分泌型蛋白。Tak－umi Shibuya等［3］通过NCBI数据库找到了VASH1的同源DNA序列，它位于人染色体1q32.3上，由355个氨基酸残基组成，命名为VASH2。与VASH1不同，VASH2在ECs上表达很低而且不能被诱导，而在Hiroshi Kimura等［5］构建的后天皮下血管新生模型中发现在距坏死边缘区渗出的单核细胞(mononuclear cells，MNCs)上特异性地检测到大量VASH2，因此当MNCs浸润时，它们可能是VASH2的主要来源。

2 VASH调节血管新生的机制

VASH1主要由内皮细胞分泌后发挥血管新生调节作用，我们知道传统的分泌蛋白通常都具有一个由连续的疏水性氨基酸组成的经典分泌信号序列，它一般位于氨基酸的N末端域，当靶蛋白通过ER膜的时候可被信号蛋白水解酶移除，于是蛋白得以分泌出来［8］。而前述VASH1是一个非传统的分泌蛋白［2］，那么ECs是如何将其分泌出来从而发挥效应作用的呢?Yasuhiro Suzuki等［9］通过酵母双杂交分析分离出一种只有66个氨基酸的VASH1结合配体—小血管新生抑制结合蛋白(Small vasohibin binding protein ，SVBP)，该蛋白通过发挥分子伴侣作用促进VASH1分泌。

VASH1翻译后产生短缩修饰，裂解为三个小亚基［10］，42kDa，36kDa 和 27kDa。通过生物分子间相互作用分析仪系统证实SVBP主要与36 kDa及27 kDa亚基结合，然后一同从细胞膜上分泌出来［9］。因此VASH1调节血管新生的机制可能是:SVBP首先在细胞内持续产生，并积聚于ECs的表面;然后VEGF及b－FGF2等血管刺激因子与其受体VEGFR2结合后，启动下游PKC－δ信号通路，从而促进 ECs上 VASH1蛋白表达增加［11］;最后翻译后的VASH1蛋白与SVBP结合促进VASH1分泌产生负性血管调节作用。X Xue等［12］研究发现VASH2在内皮细胞上的分泌机制同VASH1相同，但有趣的是，当过表达VASH2时SVBP的表达不受影响，而过表达SVBP时VASH2的分泌增加，这提示是否存在着另一促进VASH2的分泌的机制，如细胞表面通路或另一个分子伴侣，需要进一步的研究。此外，SVBP的分子伴侣作用还能增强VASH1的稳定性，抑制其被泛素蛋白酶系统降解［13－14］，但是对于 VASH2是否也有此作用尚未有相关研究证实。

3 VASH调节血管新生的时空性

研究表明VASH1及VASH2广泛表达于妊娠中期胚胎器官的ECs上，在此期可以检测到等量的VASH1及VASH2蛋白，此后从妊娠晚期至新生儿期表达开始减弱，但仍以一定程度持续表达［15］，而且两者的表达空间位置也发生了变化。H－iroshi Kimura等［12］通过建立一种后天的皮下血管新生模型，发现VASH1在出芽前缘PCNA+增殖的ECs上很少，而在终止区域PCNA－且被壁细胞包围的ECs上很多。而VASH2的空间分布正好与VASH1相反，发挥的作用也截然不同。当外源性地给予VASH1后，它抑制了内源性VASH1稀少的出芽前缘的血管新生，但是不影响内源性VASH1很丰富的终止区域的血管形成。外源性地给予VASH2后可抑制终止区域血管新生的终止以及增加这个区的血管密度。这提示外源性的VASH1主要作用区域为出牙前缘，而外源性的VASH2主要作用区域为终止区域。而内源性的VASH作用区域又与外源性的不同，研究表明基因敲除VASH1后终止区域出现血管新生，而基因敲除VASH2后出芽前缘的血管新生不足。但是VASH在调节血管新生时为何会出现这种时空性的差异的具体机制目前尚未研究清楚。

4 VASH1与角膜及脉络膜的新生血管化的关系

在低氧诱导的视网膜缺血及血管损伤后外膜血管形成中过表达VASH1能阻断病理状态下的新生血管形成，如 Shiyou Zhou 等［16－17］向碱损伤的鼠角膜模型结膜下注射重组的腺病毒编码的VASH1(AD－VASH1)后，与对照组相比，ADVASH1组角膜新生血管明显受到抑制。Ryosuke Wa－kusawa等［18］首次研究了 VASH1 在激光诱导的脉络膜新生血管化(Choroidal Neova－scularization，CNV)过程中的表达及作用，发现VASH1不仅表达于ECs，还表达于视网膜色素上皮细胞，而且VASH1蛋白注射组与VASH1基因敲除组相比，后者CNV的复原较前者好，故认为CNV损害的发展可能部分与VASH1的表达水平有关。前述ECs分泌VASH1产生抑制血管新生作用的机制涉及到PKC－δ信号通路，ariti等［19］研究发现PKC－δ－/－鼠与 PKC－δ+/+鼠相比，新生内膜损伤显著增加，免疫荧光检测发现PKC－δ－/－鼠与PKC－δ+/+鼠相比，ECs中的 VASH1更多，用小干扰RNA处理VASH1后，ECs的迁移增加，内膜损伤也加重。

5 VASH1与肾脏重塑的关系

Daisuke Saito等［20］研究VASH1对2型糖尿病肥胖鼠模型肾脏重塑的影响，发现糖尿病鼠经静脉注射腺病毒载体编码的人VASH1 8周后，可显著抑制肾小球肥大，肾小球超滤及蛋白尿，而且还可抑制肾小球内皮区CD31的增加，F4/80单核细胞/巨噬细胞的渗出以及IV胶原和系膜基质的沉积。VEGF－A被认为是一个具有很强促血管新生作用的因子，促进ECs的增殖、迁移、管腔形成［21］以及增加血管通透性［22］。研究显示在糖尿病肾病鼠模型中，VEGF－A及其受体VEGFR2的水平显著增加［23－24］。这提示 VASH1 可能通过抑制 VEGF －A及其受体VEGFR2的水平抑制肾脏重塑，从而起到保护肾脏的作用。

6 VASH与肿瘤的形成的关系

Yoshinaga先后分析了78例子宫内膜癌标本［25］及61 例宫颈鳞癌标本［26］，发现这两种癌症组织的各个病理分期VASH1的表达均高于正常组织，而且VEGF2的表达与VASH1的表达呈正相关。通过建立鼠肝细胞癌模型后21d，发现与对照组相比较，VASH1处理组肿瘤血管密度减小，且剩余肿瘤血管的管腔变得小而圆，趋于成熟［27］。与此相反VASH2在肿瘤中发挥着促进作用，首先是X Xue等［12］检测肝癌患者组织时发现VASH2的表达显著高于正常的肝细胞组织，这种促肿瘤形成作用部分是通过促血管新生实现的。因为体外实验发现将表达VASH2的肝癌细胞进行培养，并取其上清液加入培养的HUVECs，发现可促进 HUVECs增殖、迁移及管腔形成，而VASH2基因敲除后显著地抑制这种作用。与体外研究结果相符，裸鼠的体内研究模型表明外源性的VASH2显著促进肿瘤的生长，微血管密度及血红蛋白浓度的增加［12］。此外还发现过表达肝癌细胞中的VASH2时NF－κB上调了1.7±0.25倍，而 NF－κB在调节血管生长因子(如VEGF和b－FGF)促进血管新生中发挥着重要作用［28］，这提示 NF－κB 信号可能是 VASH2上调VEGF及 b－FGF2的机制。2013年Koyanagi T等［29］在人子宫内膜癌组织中发现 VASH2高表达，建立鼠动物模型，基因敲除VASH2后发现肿瘤血管的形成显著受到抑制。

VEGF在血管生长中发挥着重要的作用，因此临床上通过靶向抑制VE－GF的表达来达到治疗肿瘤的目的，但是却发现肿瘤血管新生可以变为VEGF非依赖性的，甚至在肿瘤晚期由于其它一些血管生成分子的分泌出现了VEGF抵抗的现象［30－31］，而且抗VEGF治疗还存在着血管毒性副作用，如尿蛋白的发生，因此，抗VEGF治疗并非是抗肿瘤治疗的最佳选择。因为VASH2是一种ECs非固有的且不依赖于VEGF的促血管生成蛋白，故通过抑制VASH2可抑制血管新生而不会发生ECs凋亡而导致血管毒性作用。所以VASH2的出现成为了抗肿瘤治疗的新希望。但目前这方面的研究仅限于动物实验，尚未运用于临床治疗中。

7 展望

VASH1及VASH2的时空表达类型及固有的作用效果表明它们以相互补充的方式控制着血管新生的促进及终止，使血管新生处于平衡状态，这对于维持机体的正常生理功能很重要。如果能了解清楚两者之间相互作用的机制，那么就可以将其运用于临床，控制相关的促血管新生或抑制血管新生因素，从而达到疾病治疗的目的。VASH的研究主要在肿瘤，视网膜血管新生及肾脏重塑等方面。在动物模型研究中主要是通过抑制VASH1的表达以减轻肿瘤血管新生，促使肿瘤细胞凋亡，而在视网膜血管新生疾病中也是通过抑制VASH的分泌从而抑制异常的血管新生，改善血管通透性等。目前在心血管方面疾病中尚未有VASH的相关研究，而在急性心肌梗塞中，如能通过调节VASH的分泌来促进血管新生，将极大地促进梗塞心肌的再生治疗，减小梗塞心肌面积，促使心功能最大程度恢复。

［1］Carmeliet P.Angiogenesis in health and disease［J］.Nat Med，2003，9，653－660.

［2］Watanabe K，Hasegawa Y，Yamashita H，et al.Vasohibin as an endothelium deri－ved negative feedback regulator of angiogenesis［J］.Clin Invest，2004，114:898 －907.

［3］Shibuya T，Watanabe K，Yamashita H，et al.Isolation and characterization of VA－SH2 as a homologue of VEGF－inducible endotheliumderived angiogenesis inhibitor VASH［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26:1051－1057.

［4］Kern J，Bauer M，Rychli K，et al.Alternative splicing of VASH1 generates an inhi－bitor of endothelial cell proliferation，migration and capillary tube formation［J］.Arterios－cler Thromb Vasc Biol，2008，28:478－84.

［5］Kimura H，Miyashita H，Suzuki Y，et al.Distinctive localization and opposed roles of vasohibin－1 and vasohibin－2 in the regu － lation of angiogenesis［J］.Blood，2009，113:4810－4818.

［6］Abe M，Sato Y.cDNA microarray analysis of the gene expression profile of VEGF－activated human umbilical vein endothelial cells［J］.Angiogenesis，2004，4:289 －298.

［7］Sato Y，Sonoda H.The VASH family:a negative regulatory system of angiogenes－is genetically programmed in endothelial cells［J］.Rterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27:37－41.

［8］Hegde R S，Kang S W.The concept of translocational regulation［J］.Cell Biol，2008，182:225 －232.

［9］Suzuki Y，Kobayashi M，Miyashita H，et al.Isolation of a small VASH binding pr－otein(SVBP)and its role in VASH secretion［J］.Journal of Cell Science，2010，123:3094－3101.

［10］Sonoda H，Ohta H，Watanabe K，et al.Multiple processing forms and their biolo－gical activities of a novel angiogenesis inhibitor vasohibin［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，342:640－646.

［11］Shimizu K，Watanabe K，Yamashita H，et al.Gene regulation of a novel angiog－enesis inhibitor，VASH，in endothelial cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，327(3):700－706.

［12］X Xue，W Gao，B Sun，et al.VASH 2 is transcriptionally activated and promotesangiogenesis in hepatocellular carcinoma［J］.Oncogene，2012，31:1 －11.

［13］Muchowski P J，Schaffar G，Sittler A，et al.Hsp70 and hsp40 chaperones can in－hibit self－assembly of polyglutamine proteins into amyloid － like fibrils［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97，7841－7846.

［14］Hishiya A，Takayama S.Molecular chaperones as regulators of cell death［J］.Oncogene，2008，27，6489 －6506.

［15］Adams R H，Alitalo K.Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8:464－478.

［16］Shen J，Yang X，Xiao W H，et al.Campochiaro PA.VASH is up－regulated by VEGF in the retina and suppresses VEGF receptor 2 and retinal neovascularization［J］.Faseb J，2006，20:723 －725.

［17］Yamashita H，Abe M，Watanabe K，et al.VASH prevents arterial neointimal form－ation through angiog enesis al inhibition［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，345:919－925.

［18］Ryosuke Wakusawa，Toshiaki Abe，Hajime Sato，et al.Suppression of Choroidal Neovascularization by VASH－1，a Vascular Endothelium －Derived Angiogenic Inhibitor［J］.Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science，2011，52(6):3272－3280.

［19］Xue Bai，Andriana Margariti，Yanhua Hu，et al.Protein KinaseC Deficiency Accel－erates Neointimal Lesions of Mouse Injured Artery Involving Delayed Reendotheli－alization and VASH － 1 Accumulation［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30:2467 －2474.

［20］Daisuke Saito，Yohei Maeshima，Tatsuyo Nasu，et al.Amelioration of renal altera－tions in obese type 2 diabetic mice by VASH －1，a negative feedback regulator of angiogenesis［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，300:873－886.

［21］Dvorak H F，Brown L F，Detmar M，et al.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor microvascular hyperpermeability and angiogenesis［J］.Am J Pathol，1995，146:1029 －1039.

［22］Guo M，Ricardo S D，Deane J A，et al.A stereological study of the renal glomerular vasculature in the db/db mouse model of diabetic nephropathy［J］.J Anat，2005，207:813－821.

［23］Cooper M E，Vranes D，Youssef S，et al.Increased renal expression ofvascularendothelialgrowth factor(VEGF)and its receptor VEGFR－2 in experimental diabet－ es［J］.Diabetes，1999，48:2229 －2239.

［24］Tsuchida K，Makita Z，Yamagishi S，et al.Suppression of transforming growth fac－tor beta and vascular endothelial growth factor in diabetic nephropathy in rats b－y a novel advanced glycation end product inhibitor，OPB －9195［J］.Diabetologia，1999，42:579 －588.

［25］Yoshinaga K，Ito K，Moriya T，et al.Expression of vasohibin as a novel endotheliumderived angiogenesis inhibitor in endometrial cancer［J］.Cancer Sci，2008，99(5):914－919.

［26］Yoshinaga K，Ito K，Moriya T，et al.Roles of intrinsic angiogenesis inhibitor，vasoh －ibin，in cervical carcinomas［J］.Cancer Sci，2011，102(2):446 － 451.

［27］Li D，Zhou K，Wang S，et al.Recombinant adenovirus encoding vasohibinprevents tumor angiogenesis and inhibits tumor growth［J］.Stem Cell For Research，2010，101(2):448－452.

［28］Tammali R，Reddy A B，Srivastava S K，et al.Inhibition of aldose reductase preve－nts angiogenesis in vitro and in vivo［J］.Angiogenesis，2011，14:209 －221.

［29］Koyanagi T，Saga Y，Takahashi Y，et al.Downregulation of vasohibin －2，a novel a－ ngiogenesis regulator，suppresses tumor growth by inhibiting angiogenesis in end－ ometrial cancer cells［J］.Oncol Lett，2013，5(3):1058－1062.

［30］Jain R K，Duda D G，Clark J W，et al.Lessons from phase III clinical trials on anti－VEGF therapy for cancer［J］.Nat Clin Pract Oncol，2006，3:24 － 40.

［31］Sitohy B，Nagy J A，Jaminet S C，et al.Tumor surrogate blood vessel subty－pes exhibit differential susceptibility to anti－ VEGF therapy［J］.Cancer Res，2011，71:7021－7028.