P-糖蛋白及其逆转肿瘤细胞多药耐药性的研究进展

王清 刘倩 张学梅

（大连大学医学院，辽宁大连116622）

P-糖蛋白及其逆转肿瘤细胞多药耐药性的研究进展

王清 刘倩 张学梅

（大连大学医学院，辽宁大连116622）

随着化疗药物的广泛使用，肿瘤多药耐药性是导致化疗失败的主要原因之一。而P-糖蛋白（P-gp）介导的多药耐药性已成为目前的研究热点，本文就P-gp的结构、组织分布、P-gp介导的肿瘤细胞的多药耐药性及其逆转的研究现状作一综述。

P-糖蛋白；肿瘤细胞；多药耐药性

在目前的肿瘤治疗过程中，经常会出现这样的情况，有些肿瘤在经历最初的化疗后仍会复发，可能的一种原因是肿瘤细胞对化疗药物产生了多药耐药性（MDR）导致化疗失败。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，也会对多种结构不同、作用机制不同的化疗药物产生耐药性的现象，这是一种获得性耐药。在1976年，Juliano RL和Ling V证明了MDR现象的存在与细胞膜表面的一个170 kDa的糖蛋白有关，因其能够降低药物的细胞通透性，故命名P-糖蛋白（P-gp，也称为多药耐药蛋白）[1]。很快发现，P-gp需要依靠能量将药物从细胞中去除，即它是一种腺苷三磷酸（ATP）依赖性外排泵。随着对P-gp的进一步研究，发现其不仅在人体正常组织表达，也在许多哺乳动物和人类组织的培养细胞包括各种肿瘤细胞表面表达。而且人类几乎所有的肿瘤细胞都有不同程度的P-gp表达，但对化疗不敏感或疗效差的肿瘤细胞往往有较高水平的P-gp表达[2]。因此P-gp介导的肿瘤细胞MDR已成为目前的研究热点之一。本文就P-gp的基本研究及其逆转肿瘤细胞MDR的研究进展作一综述。

1 P-gp的组织分布和生理特性

尽管P-gp在大部分人类和啮齿动物组织中的表达水平很低，但发现其在具有排泌作用的大肠、小肠、肝胆管和肾近端小管的上皮细胞表面有很高的表达量。而且在肾上腺、胎盘和大脑等组织器官也发现了这种转运体。在大脑中，P-gp主要分布于脑毛细血管内皮细胞形成的一个连续的单分子层即血脑屏障中，它不仅可以阻止血液里的药物成分进入中枢神经系统，还可以参与脑外源性物质外排入血液循环，因此P-gp是限制药物等外源性物质进入脑的一个重要影响因素[3]。同样，它也可以保护胎儿和其他敏感组织，避免各种内源性和外源性毒素的侵袭。为进一步验证P-gp的功能，制备并观察P-gp基因敲除小鼠，这些小鼠寿命正常，健康，生殖能力正常，然而当给予药物时，与野生型鼠相比其脑部药物的积累将达到很高的水平，产生一定的神经毒性。例如，P-gp基因敲除的小鼠对伊维菌素和莫昔克丁的药物敏感性均有提高[4]。

众所周知，P-gp可以影响许多临床药物的特性，在药物的吸收、分布、代谢、排泄方面有很重要的作用。在小肠中，P-gp作为一个泵可将药物外排入肠腔中，降低了药物的吸收和口服生物利用度。据预测，P-gp基因敲除的小鼠表现出从消化道摄取药物的能力明显增强，并能显著减慢药物从血液循环的消除，也能导致一些药物突然出现药物毒性[3]。这说明P-gp基因敲除小鼠在识别和证明药物在体内分布代谢方面具有很大的作用，因此可以利用基因敲除小鼠模型进行相关研究。

为保护机体免受外源物质的损害，P-gp在运输内源分子和代谢产物时也起了很重要的作用[5]。常见的内源性分子包括磷脂质、糖脂、血小板活性因子、β-淀粉样肽以及一些白介素类的细胞因子等。P-gp也可运输一些类固醇激素，如肾上腺分泌的醛固酮和子宫上皮分泌的黄体酮等。但是目前对于体内的这些内源性分子的P-gp转运体的信息是很少的。

2 P-gp的结构和对功能的影响

P-gp是一种 ATP依赖性跨膜转运蛋白，是ABC转运蛋白超家族成员之一，也是目前研究最多和了解最清楚的转运体。P-gp位于7号染色体长臂2区1带，由MDR基因1（MDR1）编码，是一个分子量为170 kDa的糖基化细胞膜蛋白。尽管其三维晶体结构尚未确定，但将它和其他ABC家族进行基因序列比较，发现它由两个同源的单体组成，每个单体包括1个含6个跨膜α螺旋的疏水性跨膜区（TMD）和1个位于胞浆内的ATP结合区也就是核苷酸结合区（NBD），这两个单体组合成位于细胞膜上的一个能量依赖性泵。近年来发现P-gp有多种的拓扑结构，这些不同的拓扑结构可能反映了其本身存在的多种结构，也可能反映其在药物运输中的不同构象，这都值得进一步研究[6]。

目前认为P-gp在分解ATP供给能量的同时，可以将肿瘤细胞内部的亲脂性化学药物排到细胞外，致使细胞内药物浓度低于杀伤浓度而使肿瘤细胞产生MDR，因此一些亲脂性药物可以竞争性抑制P-gp外排化疗药物的功能。同时P-gp诱导的MDR肿瘤中可同时检测到高水平的蛋白激酶C（PKC），PKC主要通过磷酸化P-gp药物结合位点的丝氨酸而增强其外排化疗药物的功能[7-8]。

P-gp也可与一些与其功能上不相关的复合物发生相互作用，包括化疗药物、类固醇、线形或环形多肽、荧光染料、亲离子基等，这些复合物的结构大多是含有苯环而且是相对疏水性的。然而，只有少数的受体可以直接检测到，大多数是通过细胞过表达P-gp识别的。

3 P-gp与肿瘤MDR

研究表明：许多肿瘤原发性或获得性耐药均与 P-gp高水平表达密切相关[9-10]。基于对正常组织中P-gp表达水平的研究，人们根据肿瘤组织不同的P-gp表达水平，可将肿瘤分为三大类：第1类为化疗前就高水平表达P-gp的肿瘤群，而且这些肿瘤一般起源于高度或中度表达P-gp的正常组织或器官，临床表现为原发性耐药，包括肝癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌等；第2类为中度水平表达P-gp的肿瘤，包括乳腺癌、软组织肉瘤、神经细胞瘤等，该类肿瘤最初对化疗敏感并可达到完全缓解，但复发率较高而且易产生获得性耐药；第3类则为P-gp表达水平较低或检测阴性的肿瘤，如头颈部癌、非小细胞肺癌、急性白血病等，它们对化疗药物极为敏感，一般效果显著，但和第2类相似，也易产生获得性耐药。因此在化疗前后检测病人肿瘤组织的P-gp表达情况不仅可以根据肿瘤对化疗药物的敏感度有针对性地选择化疗药物，也可以根据治疗过程中P-gp水平的变化判断是否发生MDR，以便及时调整化疗方案，而且某些肿瘤P-gp的水平还可以作为一项预后检测指标。所以在临床治疗过程中检测P-gp表达水平具有一定的意义。

在肿瘤治疗过程中化疗药物是引起 P-gp过表达的一个重要原因，同时化疗过程中的辅助用药也可诱导P-gp的过表达，这就加大了肿瘤细胞产生MDR的发生率。如通过抑制P-gp的过表达来逆转肿瘤细胞的MDR，将大大提高临床恶性肿瘤化疗的治疗效果。目前针对P-gp介导的MDR的逆转研究主要围绕着以下几个方面。

3.1 P-gp抑制剂

P-gp抑制剂作为逆转的一种方法，已被广泛深入研究，根据其研发的时间顺序分为三代。20世纪80年代生产了第1代P-gp抑制剂，如免疫抑制剂环孢素A等；钙通道阻滞药维拉帕米等；钙调蛋白阻滞药氯丙嗪等，它们均为亲脂性化合物，可通过与化疗药物竞争性或非竞争性结合P-gp，抑制其跨膜泵作用，减少化疗药物的外排。但是它们与P-gp的结合特异性非常低，而且需要增大应用剂量才能达到抑制P-gp的功能，这对人体将产生很强的毒副作用，而某些逆转剂本身就是体内其他转运系统和酶系统的底物，这样会干扰体内的一些正常代谢，特别是与化疗药物之间可产生药物代谢动力学方面的影响。这在很大程度上限制了它们的临床应用[11]。

第2代P-gp抑制剂是在第1代抑制剂结构的基础上改造合成的，主要包括PSC-833（环孢素D衍生物）、Biricodar和 VX-710等，虽然它们和P-gp亲和力更强，并且没有免疫抑制副作用，细胞毒性副作用也较低；但是它们缺乏特异性，同样抑制正常组织P-gp功能，而且还抑制细胞色素P450 3A的功能，影响药物代谢[12]，因此它们的研究也受到一定的限制。

以 tariquidar、OC144-093、zosuquidar、elacridar为代表的第3代P-gp抑制药物对P-gp亲和力更高，而且对依赖细胞色素P450 3A的药物代谢影响很小[13]，然而它们在达到抑制 P-gp功能剂量时，仍有一定的细胞毒性，目前 tariquidar、zosuquidar等第 3代 P-gp抑制药物还处于临床试验阶段[14]。肠上皮细胞中的P-gp是影响新药研发的一个重要问题，因其可导致新药物的吸收不良，从而使临床治疗无效。现在许多制药公司通常将检测药物与P-gp的相互作用作为其药物研发过程中的一部分。而目前的P-gp抑制剂在治疗癌症的临床试验中的结果是令人失望的[15-16]，可能是因为这些研究受到了一定的限制，如病人选择标准限制等。此外，目前的研究对探索应用食物或植物的天然成分作为P-gp抑制剂有很大兴趣，这可为第4代产品的发展提供一个有用的指导[16]。

3.2 抑制P-gp表达

除了上述的药物抑制剂外，还可以通过抑制P-gp的表达来逆转肿瘤细胞的MDR。除了化疗药物和辅助药物可以诱导P-gp的表达外，肿瘤细胞的某些生物学改变也会影响P-gp的表达。已经发现P-gp在转录水平受多种信号机制调节，如缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）[17]、p53[18]、染色体重排[19]、基因的甲基化修饰及乙酰化修饰等[20-21]；转录后受微小RNA（microRNA）调节[22-23]，这些信号的改变最终都会影响 P-gp的表达水平。

而拮抗P-gp表达最直接的方法就是反义核酸技术，如反义寡核苷酸技术、反义RNA技术、核酶技术等。反义寡核苷酸是一类广泛存在于生物体的基因调控分子，能通过碱基对与互补链杂交，特异地与靶细胞mRNA结合，阻止mRNA的转录、翻译，使蛋白质表达受阻，从而逆转肿瘤的MDR。Nadali F[24]等利用反义寡核苷酸在转录水平逆转了白血病细胞的MDR。但是反义寡核苷酸容易发生降解，以致作用短暂。核酶是正常存在于细胞内的一类具有RNA限制性内切酶活性的小分子RNA，它能与靶RNA分子特定位点特异结合，切割阻断目的基因的表达，因此可以设计针对MDR1基因的核酶，使其在特定位点对靶RNA进行切割，阻断P-gp的形成，从而逆转MDR。目前在下调 P-gp表达方面，研究较多的是 RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，其基本原理是内源性或外源性双链短RNA与细胞内切酶形成诱导沉默复合体 （RNA induced silencing complex，RISC），然后以干扰小RNA（siRNA）为模板，特异识别与其同源的靶mRNA，诱导其产生特异性降解，从而抑制基因表达。siRNA是一段长为20～25个核苷酸组成的双股RNA，具有很高的特异性，既不影响其他蛋白表达，也不会影响体内的药物代谢动力学，在逆转肿瘤MDR方面具有独特的优势。近年来，关于P-gp siRNA在逆转肿瘤细胞MDR方面的研究也比较多[25-27]，也得到肯定的结果，为逆转肿瘤MDR开辟了新的途径。

3.3 基因工程抗体

抗 P-gp单克隆抗体也可以作为抑制肿瘤MDR的药物[28]。单克隆抗体可特异性结合P-gp抗原表位，且不会影响细胞色素P450 3A依赖的药物代谢。目前通过基因工程手段已经可以制备人源化单克隆抗体、完全人源抗体、小分子人源抗体等。例如：以耐药细胞或耐药组织细胞膜蛋白作为抗原，筛选通过噬菌体展示技术制备的小分子抗体库，从库中筛选出抗P-gp的小分子人源抗体，可特异性识别、结合P-gp的胞外膜部分，从而逆转MDR。将具有细胞毒性的化疗药物与小分子抗体相连，借助抗原抗体结合的特性可实现药物的靶向运输，因小分子抗体的分子量小，在体内更容易进行跨膜转运，从而深入到表达P-gp的肿瘤组织中，同时其代谢速度快对正常的组织细胞影响小，而且人源小分子抗体在逆转肿瘤MDR的同时不会引起机体的变态性免疫反应，从而实现在取得良好的靶向化疗治疗效果的同时，将不良反应控制在最低水平。抗P-gp的小分子抗体无论是在制定化疗方案前对个体是否产生MDR的诊断上，还是在已产生MDR的个体治疗上，都具有深远的开发和应用前景及较高的应用价值。

4 展望

肿瘤细胞MDR已成为肿瘤病人化疗失败的主要因素，目前研究已经证明肿瘤细胞出现MDR多与P-gp过量表达有关，它已成为肿瘤化疗的最主要障碍之一。通过竞争性或非竞争性抑制P-gp功能，或直接降低P-gp的表达来逆转肿瘤细胞的MDR具有重要的临床应用意义。现在使用的逆转剂大多副作用比较大，临床应用受到很大限制，随着分子生物学技术的飞速发展，将来可能找到更多的办法来克服肿瘤的耐药性，更好地指导临床化疗，使肿瘤的治疗取得突破性的进展。

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P-glycoprotein and the Research Progress on Reversal of P-glycoprotein-mediated Multidrug Resistance of Tumor Cells

Wang Qing，Liu Qian，Zhang Xuemei
（Medical College of Dalian University,Liaoning Dalian 116622，China）

With the wide use of chemotherapy drugs，multidrug resistance （MDR）is considered as one o f the major reasons causing chemotherapy failure.The multidrug resistance mediated by P-glycoprotein （P-gp）has recently become a hot research topic.This paper briefly introduced the structure and organization distribution of P-gp and the research progress of P-gp mediated multidrug resistance of tumor cells and its reversal strategy.

P-glycoprotein（P-gp）；Tumor Cell；Multidrug Resistance（MDR）

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.03.009

2012-09-06）

国家科技支撑计划项目课题（2009BAK61B04）

王清，女，在读硕士。研究方向：基因工程抗体。E-mail：wangqing_5566@163.com

张学梅，女，副教授，硕士生导师。研究方向：基因工程抗体和糖尿病发病免疫学机制研究。通讯作者E-mail：zhangxue_m@163.com