Twist基因在胰腺癌中的研究进展

郭妍 吴伟 刘岩 路筝 李兆申

·综述与讲座·

Twist基因在胰腺癌中的研究进展

郭妍 吴伟 刘岩 路筝 李兆申

Twist基因于1983年在研究果蝇胚胎异常发育过程中被发现[1]，随后在多种动物体内及人体内发现了该基因的相似结构。它是一种位于常染色体上的编码碱性螺旋-环-螺旋转录因子，在不同种属间其核苷酸和氨基酸序列高度保守，在小鼠和人类中其氨基酸序列具有96%的同源性。近年来越来越多的研究发现，Twist不仅在胚胎发育过程中对胚层的维持、稳定起作用，而且在肿瘤转移过程对细胞间质转化、细胞运动和迁移能力也起促进作用。Twist也是一种凋亡抑制蛋白，其过量表达往往预示着肿瘤的侵袭性增加、患者的生存率低和预后差，因它可促进细胞集落形成、阻止细胞凋亡、参与肿瘤的耐药和转移。

胰腺导管腺癌(简称胰腺癌)是恶性程度最高的肿瘤之一，高居美国癌症死亡原因的第4位[2]。上海市区胰腺癌标化发病率总体呈持续上升趋势，从1973年的3.38/10万上升至2007年的6.29/10万，升高了86%，年度变化百分比(annual percentage change，APC)为1.8%(95%可信区间为1.5～2.0)[3]。大约40%的患者在诊断时就已发生局部浸润或转移，仅10%～20%的患者有机会接受手术治疗，且胰腺癌对多数抗肿瘤治疗如放疗、化疗和免疫治疗不敏感，因此其预后差。如何早期诊断、早期治疗是提高胰腺癌疗效的关键。Twist作为近年来发现的癌相关基因，在肿瘤中的作用愈来愈受到关注，今后有可能为胰腺癌的诊疗提供新的方向。为此，本文对Twist及其在胰腺癌中研究进展做一综述。

一、Twist的基本结构与功能

在脊椎动物中存在2个Twist基因，分别为Twist1(即Twist)和Twist2(dermo-1)。人类的Twist基因位于7p21.2，mRNA序列全长1669 bp，其中包含2个外显子和1个内含子，其中第1个外显子具有编码蛋白质的功能，编码由202个氨基酸残基组成的Twist蛋白。Twist蛋白分子量为26 000，等电点为9.591，是一种碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-loop-Helix，bHLH)类型的转录因子，其可以与自身或者其他蛋白质形成二聚体，并结合于特定的DNA序列E-box，使本来失活的单体形成同源或异源二聚体而获得活性，在细胞核内执行转录激活或抑制功能。

人类Twist基因突变的类型多种多样，包括无意义和错意突变、移码突变和长片段缺失突变等。这些突变可以导致多种疾病，其中最为典型的是尖头并指(趾)畸形综合征(Saethre-Chotzen syndrome)。它是一种常染色体的显性遗传病，临床表现为颅缝早闭综合征，包括尖头畸形，同时伴有短指(趾)畸形、第2指间并指以及颌面畸形等[4]。

二、Twist与肿瘤的浸润和转移

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)这一概念由Greenberg和Hay在1982年最早提出[5]，是指在某些特殊的生理或病理条件下上皮细胞表型的缺失及间质特性的获得，细胞的迁移和运动能力增强[6]。EMT现象在胚胎发育、组织发生以及多种慢性疾病的发生过程中起重要作用，同时其与肿瘤的浸润和转移过程高度相关[7]。在EMT发生过程中，伴有多个细胞分子标志的改变，例如，上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、α-连环素(α-catenin)、β-连环素(β-catenin)、γ-连环素(γ- catenin)、桥粒斑蛋白、紧密连接蛋白、黏蛋白等表达下调，间质表型标志物波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、N-钙黏素(N-cadhenin)、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)等表达上调，诱导EMT发生的细胞因子和转录因子Twist、Slug、Snail、TGF-β、Zeb、E47等表达上调。其中E-cadherin表达的变化在EMT过程中具有至关重要的作用[8]，其缺失在EMT中不仅被认为是癌细胞失去上皮特性的金标准，同时也是促进肿瘤转移的重要表现，即导致细胞失去极性和细胞与细胞间的粘附作用不稳定，以及细胞骨架的改变，从而实现细胞从原发灶中的分离。肿瘤形成局部浸润和远处转移后，再次通过间质-上皮转化定植形成转移灶。

2004年，Yang等[9]首先经体内、体外研究证实Twist基因与EMT现象及肿瘤转移的相关性。研究发现，Twist在肿瘤转移阶段表达明显增强，采用RNA干扰其表达后，乳腺癌发生远处转移的可能性降低。其可以通过转录水平启动N-cadherin，间接作用于E-cadherin的合成，抑制其转录表达，促进肿瘤细胞侵袭转移。同时Twist的表达上调可以直接与E-cadherin的启动子结合，抑制E-cadherin的表达下调，促使肿瘤细胞发生EMT。近年来的研究发现，Twist是参与EMT过程中的关键调控因子，在多种肿瘤细胞的增殖分化、转移、侵袭以及抗凋亡等过程中起了重要作用[10-13]，与多种肿瘤例如乳腺癌、食管癌、胃癌及前列腺癌等[14-17]的病理分期、预后较差及转移相关。

Satoh等[18]通过脂质体转染的方法获得稳定过表达MSX2的人胰腺癌细胞株BxPC3，结果显示E-cadhenin和β-catenin的低表达。将此种细胞注射到裸鼠的胰腺内，其肝脏和腹膜转移的发生率明显增加。使用siRNA干扰MSX2的表达后，Twist的表达下调。因此该研究认为，MSX2的表达与胰腺癌分级、血管侵袭等密切相关，而这一过程是通过提高Twist的表达介导EMT发生而实现的。童玲等[19]采用免疫组织化学法分别检测60例胰腺癌组织和20例癌旁正常胰腺中Twist及E-cadherin的表达，结果显示Twist的异常表达与胰腺癌的侵袭、远处转移密切相关，且与E-cadherin的表达负相关，对患者术后生存时间有显著影响，可能是评估胰腺癌预后的潜在指标。Hotz等[20]将5株人胰腺癌细胞株(AsPC1、CaPan-1、HPAF-2、MiaPaCa-2和PANC1)暴露于缺氧环境48 h后，细胞Twist基因的表达均明显增加。Twist在含氧量正常的肿瘤组织中不表达或微弱表达，而在缺氧条件下表达增加，亦提示Twist在胰腺肿瘤的侵袭行为中发挥重要的作用。然而，也有不同的研究结果存在。Cates等[21]采用组织芯片的方法对68例胰腺癌组织与38例正常胰腺组织及慢性胰腺炎组织进行免疫组化染色分析，结果显示正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺导管腺癌组织中均有Twist表达。在胰腺癌组织中，癌细胞的核内Twist水平较正常胰腺细胞降低。作者认为EMT相关因子的表达与胰腺癌患者的组织学分期、预后及生存期无相关性。

三、Twist与细胞凋亡

细胞凋亡是机体重要的生理过程，也是机体维持细胞数量稳定的重要机制。当局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的调控，导致单克隆性异常增生，细胞增殖失控和细胞凋亡抑制，则很可能导致肿瘤的发生。Twist通过抑制ARF-p53依赖的通路触发凋亡反应[22]。它与p53启动子上的一个重要反式激活子HOXA5相互作用，并调节其活性；同时，在Twist过表达的乳腺癌MCF-7细胞中使p53对γ射线的反应降低，同时对下游靶基因的调控能力也降低，从而达到抑制凋亡的作用。采用小干扰RNA抑制非雄激素依赖的前列腺癌细胞株DU145和PC3中Twist的表达，可以激活凋亡通路，增加抗肿瘤药物介导的细胞死亡。而此细胞系本身缺乏功能性的p53表达，因此表明Twist能够通过p53依赖性或p53非依赖性的通路调控细胞凋亡[23]。

Twist蛋白也是受NF-κB调控的抗凋亡成分，对NF-κB起到抑制作用。一方面，NF-κB在下游接收Twist的调控而激活；另一方面，它还可以通过自身的转录因子活性促进Twist的表达。Twist作为NF-κB调控的保守的转录因子，可以阻止化疗药物和NF-κB缺陷细胞中TNF-α介导的细胞程序性死亡，对阻止肿瘤细胞的程序性死亡有重要的作用[24]。

四、Twist与肿瘤干细胞

近年来人们相继在多种实体肿瘤中证实了肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)的存在[25-26]。CSCs是一群具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，虽然在肿瘤细胞总数中只占很小比例，但与肿瘤复发转移和治疗失败等密切相关。已经有研究证实，胰腺癌的发生、侵袭和转移均与胰腺癌干细胞相关。胰腺癌的标准化疗方案的客观反应率仍然较低，这可能是由于目前的标准化治疗方案只是针对循环肿瘤细胞有效，而对CSCs的作用较弱有关[26]。表达干细胞相关标志物的细胞亚群已经在多种实体肿瘤上发现，它们与肿瘤细胞的放化疗抵抗相关。有研究[27]采用高浓度的吉西他滨干预胰腺癌细胞株，收集干预后耐药存活的细胞，对包括Twist在内的若干个肿瘤干细胞标志物和EMT标志物进行检测。研究发现，在给予吉西他滨处理6 d后，所有的检测指标均上调，胰腺癌细胞的迁移能力明显增强，说明干细胞基因表达增强表现为EMT的发生以及细胞增殖能力的增强。另外，有研究报道[28]，采用siRNA干扰肿瘤干细胞标志物DCAMKL-1后发现，人胰腺癌细胞内的EMT抑制因子miR-200a被活化，从而下调包括Twist在内的多个EMT相关转录因子，抑制了EMT的发生。

五、Twist与肿瘤的化、放疗抵抗

化、放疗在肿瘤的综合治疗当中占有相当重要的地位，但与之伴随的肿瘤多药耐药性以及低放射敏感性在很大程度上影响并限制了肿瘤的治疗。通过对肿瘤多药耐药性的机制研究，发现Twist通过调控EMT参与了这一过程。Frederick等[29]报道，EMT介导了头颈部鳞癌、非小细胞肺癌对表皮生长因子吉非替尼(gefitinib)的耐药过程。Li等[30]研究发现，不同结肠癌细胞株EMT特异性分子的表达量不同，其对化疗药物的敏感性也不同。Cheng等[31]指出，乳腺癌细胞系中有Twist转录上调时，肿瘤细胞的迁移侵袭以及对紫杉醇的耐药性增加。在鼻咽癌细胞系及其耐药株的研究中发现，Twist的上调使细胞获得对紫杉醇的耐药性[32]。Wang等[33]研究发现，在鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌以及前列腺癌中，Twist水平的升高与这4种肿瘤对长春新碱的耐药有相关性，并参与了鼻咽癌对紫杉醇的耐药。Li等[12]报道，Twist的高表达与乳腺癌细胞株对阿霉素的耐药有关。

同样有研究表明，Twist也参与放疗抵抗。Tsukamoto等[34]观察到低剂量的照射可以诱导子宫内膜癌细胞株HEC1A发生EMT现象，同样条件照射另一株子宫内膜癌细胞株Ishikawa后，虽然也发生了EMT现象，但却较HEC1A明显轻微。进一步研究后证实，照射后HEC1A细胞E-cadherin的表达显著降低，Twist表达显著增高。

六、展望

综上所述，Twist是参与EMT的关键转录因子，广泛参与肿瘤发生、浸润和转移过程；并通过多种途径实现凋亡抑制作用。另外，在肿瘤细胞耐药以及放疗抵抗中也发挥重要作用。然而，从目前来看，Twist在胰腺癌的发生、发展以及化、放疗抵抗中的作用尚缺乏深入的研究，其分子调控机制尚不十分清楚。因此，进一步对Twist的深入研究，有可能将为胰腺癌的基因治疗、抗肿瘤药物的开发提供新的作用靶点，为患者制定新型的、合理的放疗方案、改善患者的预后，提供新的理论依据。

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2013-01-04)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.025

国家自然科学青年基金(8001074)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科(郭妍、刘岩、路筝、李兆申)；石家庄解放军66010部队(吴伟)；郭妍现单位：解放军第456中心医院消化内科

李兆申，Email：zhaoshenli@hotmail.com