大肠癌预防中非甾体抗炎药的新靶点及新药物的研究

陈瀚宇 王锡山

近些年的研究为非甾体抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drug，NSAID)和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制剂，在多种癌症尤其是大肠癌预防中的作用提供了强有力的支持。例如大样本人群的流行病学研究显示，长期应用NSAID，特别是阿司匹林，能显著降低结直肠癌患者的死亡风险［1］。与这类发现相类似的临床研究也显示了以舒林酸为代表的NSAID药物在家族性腺瘤息肉病患者中，有减少发病率和使癌前腺瘤退化的作用［2］。大量的前期临床实验研究发现阿司匹林和其他多种非阿司匹林的NSAID药物，在化学诱导的啮齿类动物癌症模型中有抑制肿瘤生成作用，也支持了以上临床观察研究的结论。

NSAID药物是处方药和非处方药中一个重要衍生物家族，常用于慢性炎症性疼痛的长期治疗，如关节炎。NSAID药物的抗炎作用基础是抑制环氧化酶发挥作用，从而抑制花生四烯酸向前列腺素的转化［3］。在人类身体里至少有两种COX的同工酶的表达，其中COX-2在多种病理生理条件下起重要作用［4］。NSAID在不同的选择敏感性上普遍抑制COX-1和COX-2，而像塞来昔布和罗非昔布这类COX-2选择性抑制剂则对COX-2的同工酶有高度的选择性抑制。但是，由于抑制COX-1和COX-2的作用导致的前列腺素缺失，会对胃肠道、肾脏、心血管系统产生潜在的致死性副作用［3-4］。COX-2选择性抑制剂不仅有胃肠道和肾脏的毒性，长期应用还会增加心血管意外发生风险［5］。因此，NSAID药物和COX-2选择性抑制剂作为预防癌症的预防药物是不必要也不可取的。但另一方面，由于是与COX的不可逆结合阿司匹林对结直肠癌的预防有显著收益，而除阿司匹林的NSAID，尤其是高效能的NSAID可能是通过非COX依赖机制发挥其抗癌作用。目前对于NSAID药物癌症预防机制中的生物化学和细胞学理论尚存在争议。然而已有较强的证据显示于COX-2选择性抑制剂在癌症预防上的作用，有着大量的药理学矛盾［6-8］，并且已有许多研究认为抑制剂与预防癌症无关联。有研究显示，NSAID能在完全缺失COX-2表达的情况下，仍抑制肿瘤细胞的增长［7，8］。另一些研究显示增加外源性前列腺素并不能在应用NSAID的情况下逆转其对肿瘤细胞生长的抑制作用［9］。并且NSAID药物对肿瘤细胞生长的抑制作用的程度与对前列腺素合成的抑制作用程度并不相关［10，11］。如硫化舒林酸相比于吲哚美辛对COX-1和COX-2抑制的作用明显较弱，但对于肿瘤细胞生长的抑制作用却更强［12］，如罗非昔布这类高特异性COX-2抑制剂并不能抑制肿瘤细胞的生长［13］。因此，学者们提出了大量的潜在同类靶点［1，14］。其中发现许多COX-2依赖和非COX-2依赖靶点能够有效指导癌症预防药物研发的方向，本文将对之进行介绍。并且近些年发现了许多安全性和有效性高于现有NSAID和COX-2抑制剂的新型NSAID类衍生物，我们也在此文中予以阐述。

一、COX-2靶点

目前研究显示在结肠肿瘤的生长中COX-2起着重要的作用。在90%的原发性结肠癌中均有COX-2的过表达和前列腺素水平的升高［15］。COX-2的表达水平与肿瘤的大小和侵犯度呈正相关［16］。虽然COX-2介导肿瘤生长的具体机制仍不明确，但应该涉及多种肿瘤生长的调节通路［14，17］。不论机制如何，目前研究发现降低APC基因弱表达小鼠模型中的COX-2表达，可降低其肠息肉的大小和数量［18］。塞来昔布和罗非昔布可以抑制结肠腺瘤和家族性腺瘤息肉病的生成［19，20］。但是COX-2选择性抑制剂罗非昔布和伐地昔布由于其心血管系统毒性被禁止销售，现在并不清楚这些副作用与COX-2受体相关，因为塞来昔布并未发现类似问题［5］。假设此毒性反应可能与COX-2无关，那么对已有的NSAID药物进行化学修饰可能获得更好的效果。有学者进行了一系列将NSAID类羧基基团修饰为酯类和氨基的实验，获得了吲哚美辛酸和甲氯灭酸之类的产物，增加了对COX-2的选择性［21］。目前还存在着一个潜在的问题，酯类和氨基的化学键可能没有足够的代谢稳定性，其会在代谢中变回原始的NSAID。未来还需要对衍生物的研发进行更深入的研究。

二、非COX依赖的靶点

(一)环磷酸鸟苷磷酸二酯酶(cyclicguanosine monophosphate phosphodiesterases，cGMPPDEs)超家族

NSAID的一个重要的非COX-2依赖抗癌靶点是cGMP PDEs超家族。其作为一个新兴高效能依赖磷酸二酯酶抗癌衍生物合成方向，成为近些年的研究热点。PDEs作为一类金属磷酸水解酶，能将第二信使环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)上的3'端和5'端的环磷酸水解为5'-单磷酸，进而中止环磷酸核苷酸耦合受体通路中细胞内信号传递［22］。PDEs超家族包括分属于11个蛋白家族中的大概100种确切的蛋白异构体，其中每一种蛋白对于cAMP和cGMP的选择性、对抑制剂和激动剂的敏感性、以及在不同组织、细胞内分布浓度均各不相同。增强细胞内的环磷酸核苷酸水平能激活特异的信号通路，如cGMP的增加，能激活cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)-环磷酸核苷酸门控例子通道，激活特定的cGMP结合性PDEs，这些在细胞活性中扮演重要角色［22，23］。研究已经证实cGMP传导通路在结直肠肿瘤的生长中发挥着作用。例如，人类结肠肿瘤中存在cGMP特异性PDE5同工酶水平高表达［12］。并且，有学者发现在结肠的腺瘤和腺癌中，膜相关性鸟苷酸环化酶类似物和尿鸟苷素的mRNA水平均有减少。而口服尿鸟苷素可在APC基因弱表达的小鼠模型上产生促肿瘤细胞凋亡进而抑制肠道肿瘤生成的作用［24］。接下来的实验显示，特定的cGMP-PDE水平在结肠肿瘤中升高，导致了cGMP水平的降低，抑制了肿瘤细胞的增值和存活。除cGMP，其它相关的cGMP-PDE同工酶在调节cGMP的合成和下游信号通路中的具体作用机制在肿瘤生成中起作用。目前还缺乏足够的研究。已有研究显示某些NSAID和COX-2抑制剂能在结肠癌细胞系内同时抑制cGMP-PDEs的同工酶进而增加细胞内cGMP水平，激活 cGMP信号传递［25，26］。然而 NSAID药物对肿瘤细胞生长的抑制作用需要在较高的浓度和他们对cGMP-PDE抑制能力之间存在很强的关系(特别是cGMP特异性PDE同工酶-PDE5)，也就是说这些效果需要在高浓度下才能达到，但是在体内并不能安全的达到此浓度［12］。另外，有些已经发现的PDE5特异性抑制剂(MY5445)和非选择性cGMPPDE抑制剂(MY5445，曲奎辛)也能抑制肿瘤细胞的生长［27］。同样用siRNA或者反义核酸进行PDE5基因敲除同样达到此效果［27］。然而，其他高度选择性的PDE5抑制剂(西地那非)，通常在比抗肿瘤浓度更高的浓度下用于勃起功能障碍的治疗，这也提示了其他的cGMP-PDE同工酶可能参与其中［28］。在大量的已经证有cGMP-PDEs抑制功能的NSAID中，硫化舒林酸的活性最强［12］。由于非COX-2抑制类的砜基舒林酸也能抑制cGMP-PDEs，虽然效能相对较弱，但也侧面证实了这一类复合物的COX-2抑制活性可能与cGMP-PDEs的抑制作用并不相关［29］。一开始学者们致力于合成去除COX-2抑制活性的舒林酸衍生物，但是却通过硫基和羧酸基团的改造提升了cGMP-PDEs的抑制活性［30］。这些得到了大量的体外高效能衍生物，能够抑制结肠肿瘤细胞生长、介导细胞凋亡。但是这些衍生物的口服生物利用度和代谢稳定性却并不让人满意，阻碍了这些衍生物的进一步应用［30］。这些衍生物的发现也显示了cGMP-PDE在减轻其毒性的前提下，是一个高效可用的抗肿瘤靶点。尽管口服吸收率差，口服剂量过高都限制了这类药物的发展，但类似衍生物或者改善生物利用度的优化配方应该有很大的发展前景和特有优势。

(二)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生

现已证实在癌症中氧化还原信号系统存在异常，但是仍需要确定活性氧簇在肿瘤生长中是否起着推动作用。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在癌症中起着双向作用，一方面在多种癌症中都有ROS水平异常升高［31］，并且与肿瘤生成相关的慢性炎症中也有ROS高水平。肿瘤中较高的ROS水平与基因的不稳定性、细胞增殖、血管的生成和凋亡的异常关系密切［31，32］。另一方面，ROS有着杀伤肿瘤细胞和诱导细胞凋亡的作用，是新型抗癌药物的重要靶点。有学者报告了两个备受关注的NSAID衍生物系列:一氧化氮供体型非甾体抗炎药(NO-NSAIDs)和磷酸化非甾体抗炎药(phospho-NSAIDs)，通过提升细胞细胞内ROS水平并激活前凋亡氧化还原通路来发挥肿瘤预防作用［33］。NO-NSAIDs的为一个一氧化氮释放基团通过化学连接物与一个母体化合物，如阿司匹林与舒林酸或甲氧奈丙酸相连接。此目的最初在于增高肠内的一氧化氮水平，增加血供以起到降低NSAID类药物胃肠道毒性。对NO-NSAID的研究显示其无论是在体内还是在体外，对于结肠癌的化学预防作用都较传统的NSAID效果更好［34］。为了确定在增强癌症预防效果中一氧化氮基起到的作用，学者们制造了以磷酸二乙酯替代一氧化氮基团的化合物。有趣的是，这些磷酸化NSAID药物衍生物显示了和NO-NSAIDs相类似的抗癌活性。这证实了新的NSAID化合物的抗癌活性的增强并不是单纯因为一氧化氮的释放，还有对NSAID化学修饰产生的结果［35］。无论原始的NSAID对一氧化氮还是对磷酸二乙酯基团进行替代，新的衍生物都能在体外肿瘤细胞内引起ROS水平的提升，并且在动物结肠癌模型中显示出更好的抗肿瘤效果［33］。虽然这类衍生物的研发上还有很多路要走，但其通过激活氧化还原信号进而介导结肠肿瘤细胞凋亡，在结直肠肿瘤的预防上展示了很好的前景。

(三)Survivin的下调

Survivin是一种凋亡抑制蛋白，能阻断胱天蛋白酶(caspases)的激活，是一种重要的凋亡介导因子［36］。在成人组织中正常并无Survivin的表达，而在大多数的癌症中均有Survivn的过表达，并且这种蛋白的表达水平和肿瘤的分期和预后有着很强的关系［36，37］。同时，Survivin的表达也与患者p53状态和化疗的敏感性有紧密的联系［38］。

大量的NSAID和COX-2选择性抑制剂能够下调肿瘤细胞内Survivin的表达并降低其活性，而其中效果最突出的就是塞来昔布［12，39］。而 2，5-二甲基-塞来昔布(2，5-dimethylcelecoxib，DMC)作为塞来昔布的衍生物并没有COX-2抑制活性，但仍有着抗癌活性，并且在抑制Surivin的效能上优于塞来昔布。更令人欣喜的是DMC在多种癌症模型上都显示出了体内抗癌能力［39］。

(四)其他非依赖COX的靶点

其他在结肠癌肿瘤生长中发挥作用的已知靶点也都与NSAID的作用位点相关。然而，这些靶点和NSAID的抗癌作用联系相对较弱，并且在非依赖COX抑制的衍生物里并未发现这些靶点的抗癌活性。虽然如此，这些靶点也仍然在以后的药物研发中有着巨大的潜力。在这其中一个重要的靶点就是过氧化物酶体增殖物激活受体c(peroxisomal proliferator-activated receptor c，PPARc)。PPARc在结肠癌细胞中能抑制细胞生长并且促进分化［40］。大量的研究已经显示特定的NSAID能直接结合并激动PPARc并且PPARc的激动与肿瘤生长抑制相关［41］。

细胞核因子κB(nuclear factor kappa B，NFκB)是另一个NSAID类潜在的非依赖COX-2性抗肿瘤靶点。NFκB是一个能促进细胞生长、抑制细胞凋亡的重要的转录因子［42］。在多种癌症中均发现 NFκB的活性升高，其原因可能为NFκB的过表达或是细胞核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NFκB，IκB)的下调。IκB 是一种调节蛋白，其通过在细胞中激活NFκB灭活通路而阻断 NFκB的转录活性［43］。有些NSAID类药物，特别是水杨酸盐类已经证实能够抑制NFκB转录，其可能的机制是能够阻止IκB的降解［44］。

目前有学者提出了一个比较新颖的NSAID抗癌活性的机制，NSAID 激活基因(NSAID-activated gene，NAG-1)。NAG-1 是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族中的一员，有着促凋亡和抗增殖作用，但其具体机制仍未被详细揭示［45］。大量不同的NSAID包括吲哚美辛、阿司匹林、布洛芬d等都能够上调NAG-1在结肠癌细胞内的表达，并且此效果并不依赖COX的表达。然而，由于激活NAG-1所需的浓度显著低于能够介导凋亡和抑制生长的浓度，NSAID的抗癌活性和它激活NAG-1表达的效能之间并无明显联系［45］。并且目前尚未在体内研究中发现NSAID对NAG-1表达水平的影响。

尽管microRNA并不是NSAID的直接靶点，但也是影响肿瘤细胞对NSAID敏感性的重要因子。microRNA是一系列自然存在的小RNA分子，能够通过与同源靶基因结合进而调节近30%的人类基因，并且参与许多基本的生物学活动，例如细胞生长、分化、凋亡和肿瘤生长等［46］。这些功能都显示了他在肿瘤诊断，预后评估和治疗中有着重要的临床应用价值。在近年的研究中，有学者发现在经过硫化舒林酸盐治疗结肠肿瘤患者的细胞标本中有一组microRNA(miR－10b，－17，－19，－21，－9)显示出表达的抑制43］。而已有的研究显示这些microRNA的水平升高与肿瘤的转移和侵袭密切相关［47-49］。因而这些microRNA可能对硫化舒林酸抑制肿瘤细胞侵袭起到调节作用。

各种NSAID类药物都有着抗炎作用。在溃疡性结肠炎和其相关的结肠癌中，炎症反应的持续损伤和修复扮演重要的角色。这些炎症反应过程不仅会提高ROS的水平，还与细胞的死亡和增殖相关。这些炎性改变可能是通过上皮细胞内DNA修复酶的抑制导致基因突变，进而引起肿瘤发生相关的信号通路分子水平的变化［45］。因此，许多NSAID类药物引起的抗癌相关指标改变还可能与它们的抗炎作用相关。这两种作用是否能完全区分还需深入讨论。

三、结论

NSAID类是一类数量繁多的药物衍生物，有着多种多样的生物学功能。其中有些功能与抗癌作用相关，而还有些与毒性反应相关。在过去20年对于其抗癌机制的实验研究显示:COX的抑制很可能与抗癌作用无关。因此，可以通过研究改善NSAID以得到更佳的抗肿瘤效果和较小的毒性。由于NSAID类的抗肿瘤活性机制非常复杂，大量的研究揭示了许多潜在的靶点。传统的NSAID和COX-2选择性抑制剂很可能通过依赖COX和非依赖COX的机制联合发挥抗肿瘤作用。然而随着对无COX抑制活性的NSAID类衍生物的研究，显示这一类药物对于肿瘤细胞生长的抑制发挥出了更好的效果和更高的选择性。因此，对NSAID的非依赖COX作用机制的研究就成为了重要科研方向。而其中最大的挑战就是确定结肠癌肿瘤细胞生长的分子靶点和合适的药物化学骨架，以能得到拥有更好效果、更低毒性的药物。

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