野生型大鼠Rab5a基因表达载体pcDNA3-Rab5(a)WT的转化扩增及鉴定
2013-01-14杨俊俊贺斌峰王关嵩
孙 欢 杨俊俊 贺斌峰 王关嵩
孙 欢，杨俊俊，贺斌峰，等.野生型大鼠Rab5a基因表达载体pcDNA3-Rab5(a)WT的转化扩增及鉴定［J/CD］.中华肺部疾病杂志:电子版，2013，6(6):504-507.
Rab5作为Rab GTPase蛋白家族的一员，在细胞生命活动中发挥着重要作用，参与调控细胞内吞过程、细胞极化、细胞自噬、细胞迁移、有丝分裂及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)等信号通路，在肿瘤、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)等疾病中具有重要意义［1-2］。转染质粒载体携带的目的基因是体外试验研究的重要手段。Rab5(a)WT是Rab5a基因的野生突变体，是Rab5研究中的重要工具，因此，本研究用 DH5α感受态菌转化筛选并扩增了pcDNA3-Rab5(a)WT质粒载体，旨在为基于Rab5相关研究提供优质的表达载体。
材料和方法
一、实验材料
大鼠Rab5(a)WT基因表达载体pcDNA3-Rab5(a)WT由Wuguangyu教授馈赠;大肠杆菌 DH5α和LB培养基由第三军医大学新桥医院中心实验室馈赠;质粒小抽试剂盒购自南京凯基生物科技发展公司;PCR试剂盒购于 Takara公司;PCR仪型号为Gene Amp PCR System 9700;ND2000超微量核酸蛋白测定仪(Thermo公司)。Rab5a引物序列:Sense:5'TGTTGGCAAATCAAGTCTGGT 3';Antisense:5'TGCTAAGTCAGCCTTGTTTCCT 3'。
二、实验方法
1.pcDNA3-Rab5(a)WT的转化:利用CaCl2法制备DH5α感受态菌，将5 μl重组质粒加入60 μl预冷的0.1 mol/L CaCl2中冰浴30 min，再经42℃水浴90 s后迅速放回冰浴中3 min;在上述体系中加入1 ml LB培养液，37℃下剧烈振荡培养1 h。
2.pcDNA3-Rab5(a)WT转化菌的抗性筛选:取上述培养体系100 μl涂布于含100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板(直径100 mm)上，置平皿于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，16 h后观察菌落生长情况;挑取5个菌落，分别培养于30 ml含100 μg/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中，于37℃下振荡(200 r/min)培养过夜。
3.质粒抽提、纯度分析:取上述过夜培养的菌液，按照质粒抽试剂盒说明提取质粒，ND2000超微量核酸蛋白测定仪分析提取质粒的纯度和浓度，取2 μl提取的质粒样品进行琼脂糖电泳。
4.pcDNA3-Rab5(a)WT质粒鉴定:取适量质粒DNA进行稀释到适宜浓度后，利用大鼠Rab5a引物进行 PCR反应。反应体系如下:Premix 10 μl，cDNA 1 μl，引物 10.5μl，引物 2 0.5 μl，ddH2O 8 μl。PCR仪进行反应，按以下循环条件:94℃5 min;94℃30 min;94℃5 min;55℃30 min;72℃ 40 min，进行30 cycles;72℃ 10 min;4℃储存。
结 果
一、pcDNA3-Rab5(a)WT质粒转化DH5α的克隆筛选
在含氨苄青霉素的LB平板上，转化pcDNA3-Rab5(a)WT质粒的DH5α菌呈克隆样菌落生长，见图1。
图1 pcDNA3-Rab5(a)WT质粒转化DH5α菌氨苄青霉素平板抗性筛选
二、扩增pcDNA3-Rab5(a)WT质粒的纯度和浓度
经转化和克隆筛选，提取的5个pcDNA3-Rab5(a)WT质粒标本其A260/A280比值及浓度如表1所示。质粒电泳超螺旋构象得到的量最多且条带清晰，说明提取的质粒纯度高，质量好，见图2。
图2 pcDNA3-Rab5(a)WT质粒的凝胶电泳
三、pcDNA3-Rab5(a)WT的PCR鉴定
5个Rab5(a)WT质粒DNA标本经PCR后，得到大小为325 bp的Rab5a基因产物，见图3。证实转化扩增后抽提的质粒DNA确实为pcDNA3-Rab5(a)WT。
图3 Rab5(a)WT质粒PCR产物的凝胶电泳
四、pcDNA3-Rab5(a)WT质粒模式图
利用DNAMAN软件绘制质粒模式图得到如下结果，见图4。
表1 提取的pcDNA3-Rab5(a)WT质粒的纯度和浓度
图4 pcDNA3-Rab5(a)WT质粒模式图
讨 论
质粒转染细胞的效率与质粒产率、质粒超螺旋比例、纯度、RNA残留量、内毒素含量及其途径等密切相关［3］。研究表明pcDNA3-Rab5(a)WT质粒浓度在200 ng/μl以上，超螺旋比例高时其转染效率及表达量较高［4］。本研究利用热休克法(CaCl2法)有效地进行了质粒的转化，同时利用常规方法进行扩增，无内毒素的质粒抽提试剂盒从菌液中提取质粒，最后得到了浓度高、超螺旋比例高、纯度高、RNA残留量少、无内毒素的优质质粒，为后续研究提供了充足的实验材料。由表1可见，5个pcDNA3-Rab5(a)WT质粒标本纯度和浓度均较高。琼脂糖凝胶电泳(图2)可见，5个pcDNA3-Rab5(a)WT质粒标本均具有最多的超螺旋结构;利用Rab5a引物对pcDNA3-Rab5(a)WT质粒标本进行PCR扩增后，凝胶电泳PCR产物条带均为325 bp大小的Rab5a基因(图3)。
以往研究表明，Rab5在细胞功能调节中发挥着重要作用，其参与囊泡运输的内吞过程的研究最为广泛和明确，包括调控配体在细胞膜上的扣押，通过募集下游作用蛋白调控初级内涵体的停泊和融合，以及沿着微管的运动等［5-8］。同时，Rab5通过多种机制参与调控肿瘤细胞迁移，介导黏着斑形成，协同Caspase-8的作用，通过调控β1整合素的转运，诱导板状伪足形成等［9-11］。在宫颈癌细胞，Rab5a可能通过整合素介导的信号通路调节侵袭表型，并促进肿瘤转移［12］。Rab5不仅能调控肿瘤细胞的迁移能力，对大脑皮层发育过程中未成熟神经细胞的迁移也发挥重要作用，其机制可能是通过调控N-钙黏蛋白介导细胞黏附［13］。另外，Rab5可通过 mTORC1调控细胞自噬功能，还能直接增强吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用，抑制Rab5可导致丙肝病毒非结构蛋白4B或丙肝病毒诱导的自噬囊泡形成显著减少［14-15］。新的研究表明，Rab5在有丝分裂中也发挥作用，下调后可减弱染色体稳定性，提示了膜代谢与纺锤体功能间存在某种调控关系［16-18］。因此，目前随着Rab5相关研究的逐步深入，Rab5(a)WT作为重要的工具应用越来越广泛，本研究中通过转化扩增提供了充足的Rab5(a)WT质粒载体，为后续关于Rab5和肺微血管内皮细胞囊泡运输的机制研究提供了不可或缺的原材料。
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