泰安市2010～2012年手足口病不同标本检测结果分析

张荣强 侯佩强 倪 楠 张爱华 杨会利

(泰安市疾病预防控制中心，山东 泰安 271000)

手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病。多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡[1-2]。2008年安徽爆发手足口病，该病引起全国关注，至今国内已出现多次暴发或流行。但由于该病致病机制尚不清楚，目前没有有效的预防和治疗药物及疫苗。

1 材料和方法

1.1 标本采集对象的选择和数量

标本采集对象为疫情出现时手足口病的临床诊断病例。用于进行检测的标本有粪便、咽拭子和血清，以及患者出现神经系统症状时医院采集的脑脊液标本。临床标本在运输和贮存过程中避免反复冻融，如果不能确保-20℃的条件，应该在0～8℃运输和保存。进入实验室后，不能立即进行检测的放置于-80℃冰柜中低温保存。其中包括本地医院临床诊断为HFMD患者的粪便1356份、咽拭子标本68份，血清98份，脑脊液156份。

1.2 标本种类及采集、运送

粪便标本：采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5～8 g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存或12 h内送实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-80℃冰箱。

咽拭子标本：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3 ml Hank’s保存液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存或12 h内送实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-80℃冰箱。

血清标本：采集发病0～3 d的急性期病例血清用于抗体检测。静脉采集3～5 ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存。

脑脊液标本：对出现神经系统症状的病例，采集脑脊液标本，进行病原检测。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0～2.0 ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存或12 h内送实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-80℃冰箱。

1.3 主要试剂和仪器

核酸提取试剂(High pure Viral RNA kit，瑞士Roche公司),手足口病荧光定量检测试剂(上海之江公司),荧光定量PCR仪(ABI7500型，美国AB公司)，低温高速离心机3-18K(德国Sigma公司)，台式高速离心机(德国Eppendorf公司),凝胶自动成像系统(美国Alpha公司)。

1.4 标本处理

在生物安全柜内，取5 g左右的手足口病病例的粪便标本，放入50 ml离心管，标记标本号，每管中加入10 ml PBS、1 g玻璃珠和1 ml氯仿；用振荡器剧烈振荡40 min；用冷冻离心机1500 g离心20 min；在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个带螺旋盖的冻存管中；一管粪便悬液冻存于-70℃作为备份，另一管用于病毒检测和病毒培养。

咽拭子要在标本保存液中充分搅动或振荡(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次(防止多次冻融)，使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4℃条件下，10000 r/min离心20 min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。脑脊液标本和血清标本直接用于检测和病毒分离。

1.5 RT-PCR反应条件和反应参数

PCR反应体系的配置：50 μl：无RNA酶水(Rnase Free Water)，28.8 μl；5×Buffer，10 μl；10 mM dNTP，2μl；Enzyme Mix，2 μl；Rnase inhibitor， 0.2 μl；上游引物，1 μl；下游引物，1 μl；RNA模板，5 μl。

反应步骤：逆转录42℃，45 min；95℃，3 min；扩增95℃，20 s，45℃，25 s ，72℃，30 s；32个循环，再延伸10 min。

结果分析：用Alpha凝胶成像系统观察电泳结果，并进行核酸分析和电泳图片保存。

1.6 Real time-PCR扩增

荧光定量PCR法的反应体系和反应参数依据试剂说明书操作。

1.7 统计学处理

分类数据采用频数及百分数表达。不同阳性率之间的比较，采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同标本之间检测结果

2010～2012这三个检测年度，对手足口病患者所采集的标本有粪便标本、咽拭子标本、脑脊液和血清四类。在粪便标本中，剔除肛拭子标本和部分不合格标本，选择标本为1356份。其中，粪便和咽拭子两类标本核酸检测的肠道病毒阳性率分别为81.86%和39.70%，粪便标本的肠道病毒阳性率明显高于咽拭子标本，经统计学处理，χ2=27.05，P<0.01，两类标本的阳性率之间具有显著性差异。虽然脑脊液标本分离到病毒对手足口病的诊断有重要意义，但是其核酸检测的阳性率却非常低，只有7.69%，和粪便、咽拭子标本的差异有显著性。急性期的血清标本采用ELISA检测，虽然只能检测EV71和CVA16，但阳性率较高，为62.24%，和粪便标本的EV71和CVA16两个病原体之和的阳性率62.83%(852/1356)比较，呈显著性正相关(χ2=0.03，P<0.05)。不同标本的阳性率情况见表1。

表1 2010～2012年手足口病不同标本的阳性率[n(%)]

2.2 RT-PCR和Real time-PCR检测结果

2.2.1手足口病的RT-PCR检测结果 10份标本的手足口病肠道病毒通用引物RT-PCR结果显示，10份标本均为阳性，基因扩增片段为116 bp(图1)。16份标本的手足口病肠道病毒EV71特异性引物的RT-PCR结果显示，2,3,4,6，9，10,16号标本为阳性，基因扩增片段为226 bp(图2)。手足口病肠道病毒CVA16特异性引物的RT-PCR结果显示，1,2,3,4,5,6,7,10号标本为阳性，基因扩增片段为208 bp(图3)。

图1 手足口病肠道病毒通用引物RT-PCR结果

图2 手足口病肠道病毒EV71特异性引物RT-PCR结果

2.2.2手足口病的Real time-PCR检测结果(图4)

3 讨 论

HFMD传播快，流行性强，对5岁以下儿童危害尤其严重。HFMD属自限性疾病，多表现为轻症，但部分病例可发展为重症，甚至危及生命[3]。引起HFMD的病原体主要为小RNA病毒科肠道病毒属的柯萨奇A组的4、5、7、9、10、16型，B组的2、5、13型，部分埃可病毒和肠道病毒71型。其中以柯萨奇病毒A组的16型和肠道病毒71型最为常见[4]。

图3 手足口病肠道病毒CVA16特异性引物RT-PCR结果

图4 手足口病病毒的实时荧光定量PCR检测结果(ABI7500)

所采集的标本主要有粪便标本和咽拭子标本两类，两类标本的肠道病毒的阳性率分别为81.86%和39.70%，粪便标本的阳性率明显高于咽拭子标本。另外，虽然脑脊液标本分离到病毒对手足口病的诊断有重要意义，但是其核酸检测的阳性率非常低，我们收集了本市妇幼保健院所采集的156份临床脑脊液标本，并对其进行了检测，肠道病毒通用引物只有12份阳性，阳性率为7.69%，和粪便、咽拭子标本的差异有显著性。急性期的血清标本采用ElISA检测，虽然只能检测EV71和CVA16，但阳性率较高，分别为28.57%和33.57%，和粪便标本的这两类病原体检测结果比较，呈显著性正相关。对急症期的手足口病入院儿童，开展血清检测EV71和CVA16的相关抗体，可以对HFMD起到初步诊断作用，这有利于对重症病例病原的判断。

本区域三个年度的1356例手足口病粪便标本中，肠道病毒阳性标本数为1110例，其中EV71和CVA16分别是348例和504例，主要病原体以EV71和CVA16为主，其中CVA16略高，另外尚有258例肠道病毒阳性的标本不是EV71和CVA16，而是其他病原体，由于还没有特异性的检测方法，因此无法了解这部分病例病原体的具体病毒型别。虽然近三年本区域CVA16的核酸检测阳性率高于EV71，但是无论在病毒的活跃程度上还是在病毒造成疾病的严重程度上，EV71都应该更引起人们的重视[5]。下一步应开展更深入的监测，获取更多的病原学资料，进一步开展病毒的型别与变异监测，更深入地了解病毒流行规律，对疫情早发现、早治疗，减少其对人民健康的危害。

[1] 周世力,杨帆,金奇,等.肠道病毒71型的研究进展[J].病毒学报,2003,19(3):284-286.

[2] 崔爱利,许文波,李秀珠.肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征[J].病毒学报， 2004, 20 (2):16-165.

[3] 牛文柯, 林艺, 丁淑军, 等. 山东省EV71和CoxA16所致手足口病重症病例流行病学及临床特征分析[J].中国病原生物学杂志,2012,7(2):101-103.

[4] Robinson CR, Doanc FW, Rhodes AJ. Repor of an outbreak of febrile illness with pharyngeal and exanthen: totonto, 1957 Isolation of group A Coxsackie virus[J]. Canada Med Assoc J, 1958,79(3): 615-621.

[5] 郑书发,崔大伟,余斐,等.浙江省杭州地区手足口病病原谱分析和肠道病毒71 型VP1基因分析[J].现代预防医学,2011,38(2):305-308.