朱砂七总蒽醌对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

赵 勤 赵 铭 卢 健 卫 昊 郭惠玲

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046； 2.咸阳市中心医院，陕西 咸阳 712000)

朱砂七，为蓼科植物毛脉蓼Polygonumciliinerve(Nakai)ohwl.的块根，为“太白七药”之一，天然资源十分丰富。其味苦，性凉，能清热解毒、止痛止血，主治扁桃体炎、胃肠炎、尿路感染等感染性疾病。近年来我们研究发现朱砂七总蒽醌具有抗炎、镇痛、抗病毒的作用，并对多种肿瘤具有抑制和促进其凋亡的作用[3-8]。但是关于朱砂七总蒽醌对于人肝癌抗肿瘤效果未见有报道，作用机制也不清楚，为此我们选择人肝癌SMMC-7721细胞从体外对其抗肿瘤作用进行研究，并初步探讨了其抗肿瘤的可能机制，以期为朱砂七总蒽醌抗肝癌奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1药品

朱砂七总蒽醌(ZSQ，由本实验室提取)，溶于无血清的DMEM培养液中配成64 mg/ml的储存液，分装，4℃保存。

1.2主要试剂与仪器

DMEM培养基(Hyclone公司)；EDTA、EB、PFA、柠檬酸钠(国产)；MTT、苏木精、伊红(Sigma公司)；四氮哇盐(MT)和二甲基亚矾(DMSO)，Sigma公司；TUNEL试剂盒(Roche公司)；CO2培养箱(3111型，美国)；酶联免疫检测仪(DG-5031型，国营华东电子管厂)；分析天平(A120S型，德国)；净化工作台(ZYJ-L型，富康集团安泰公司)；倒置显微镜(XDS-1型，重庆光学仪器厂)。

1.3瘤株和细胞株

SMMC-7721细胞(人肝癌细胞株)由第四军医大学口腔生物实验室提供。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养 将人SMMC-7721细胞株复苏后，用含10%胎牛血清DMEM培养基在37℃，5%CO2的培养箱中培养，传代，取生长状态良好的对数生长期的细胞实验。

1.4.2MTT法测定朱砂七总蒽醌对SMMC-7721细胞增殖的影响 取对数生长期的SMMC-7721细胞，调整细胞密度3×104个/ml接种于96孔培养板中，100 μl/孔，培养24 h后分别加入32，3.2，0.32，0.032 mg/ml 浓度的朱砂七总蒽醌药液，另设空白对照组和细胞对照组，每个浓度设4个复孔。37℃，5% CO2培养24 h、48 h和72 h，实验结束前4小时每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，37℃，5% CO2继续培养4 h后吸去上清液，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min使甲攒完全溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测各孔吸光度(A值)，按下列公式计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4.3细胞形态学观察 将对数生长期的SMMC-7721细胞调整为1×105个/ml，接种于50 ml培养瓶中培养24 h后，加入终浓度分别为0.32，3.2，32 mg/ml的朱砂七总蒽醌药液，空白对照加等量的培养液；37℃，5%CO2，培养48 h后收集细胞，PBS漂洗，滴片，自然晾干；用甲醛固定，苏木素和伊红进行HE染色，乙醇脱水、二甲苯透明，以树脂封片，显微镜下观察并照相。

1.4.4TdT酶介导的原位末端标记法(TUNEL)观察 试剂盒为Roche公司产品，按其说明书操作。取对数生长期的SMMC-7721细胞，调整其密度为1×105个/ml接种于有盖玻片的12孔培养板上，24 h后分别加终浓度为32，3.2，0.32 mg/ml的朱砂七总蒽醌药液，空白对照加等量的培养液；37℃，5% CO2，培养48 h后，将吸附细胞的盖玻片用4%多聚甲醛室温固定30 min，0.5% H2O2甲醇溶液灭活内源性过氧化酶，0.1%TritonX-100 4℃渗透2 min，冲洗，待玻片干后，每张玻片加30 μl的TUNEL反应液，37℃孵育30 min，冲洗后再加入30 μl的Coverter-POD液，37℃孵育30 min，PBS冲洗，滴加100 μl DAB显色液，室温避光显色10 min。蒸馏水冲洗，脱水，透明，封片，显微镜下观察并照相，DAB显色后凋亡细胞呈棕褐色，高倍镜下记数凋亡细胞，计算凋亡率。

2 结 果

2.1朱砂七总蒽醌对SMMC-7721细胞增殖的影响 MTT实验结果显示，经朱砂七总蒽醌分别处理SMMC-7721细胞24 h、48 h和72 h后，A 值分别比未经处理的SMMC-7721细胞显著下降(P<0.05，P<0.01)，对细胞增殖的抑制率随着剂量的增加和时间的延长显著升高，见表1。

表1 朱砂七总蒽醌对SMMC-7721生长的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2朱砂七总蒽醌对SMMC-7721细胞的形态学影响 HE染色后，在倒置显微镜下观察：正常对照组的SMMC-7721细胞形态完整，胞膜胞核完整，胞浆丰富、未见明显的细胞聚集；经朱砂七总蒽醌处理过的SMMC-7721细胞皱缩，胞浆稀少或缺乏，细胞质染成粉红色，细胞核固缩、碎裂、染成蓝紫色，细胞核固缩碎裂成数个圆形颗粒，出现凋亡改变，凋亡小体形成。32 mg/ml组核染色消失，呈均质红染的无结构形态，结果见图1。

图1 SMMC-7721细胞经过48 h培养的HE染色结果

2.3TUNEL 法检测朱砂七总蒽醌诱导SMMC-7721 细胞凋亡 SMMC-7721细胞经朱砂七总蒽醌32，3.2，0.32 mg/ml三个剂量分别处理48 h后，均出现棕褐色的凋亡细胞染色阳性颗粒，尤其32 mg/ml剂量下，细胞核固缩成棕褐色浓染的凋亡小体，镜下计数，凋亡细胞百分率分别约为62.1%，25.8%，14.50%，且随作用浓度增加而增加，而空白对照组为0.50%，见图2。

图2 SMMC-7721细胞经过48 h培养的TUNEL检测结果

3 讨 论

本实验以人肝癌SMMC-7721细胞为靶细胞，研究了朱砂七总蒽醌对SMMC-7721细胞增殖的影响，结果表明，朱砂七总蒽醌具有明显抑制SMMC-7721细胞增殖的作用，抑制率最高可达到83.82%，且其抑制作用呈明显的剂量和时间依赖关系。为探讨其抑制肿瘤细胞增殖的作用是否和诱导细胞凋亡相关，我们通过HE染色从形态上观察到朱砂七总蒽醌处理过的SMMC-7721细胞皱缩，染色质浓缩，细胞核固缩碎裂成数个圆形颗粒，凋亡细胞形成且数量较对照组增多, 表明朱砂七总蒽醌可诱导肿瘤细胞凋亡。由于HE染色结果只能定性, 不能定量, 因此我们进一步采用TUNEL法对凋亡细胞进行定量分析。TUNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色, 能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征[9], 是目前较为灵敏和特异的检测技术, 因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。本实验结果表明, 朱砂七总蒽醌组凋亡细胞百分率显著高于对照组, 说明其在体外可诱导肝癌SMMCC-7721细胞凋亡。

细胞凋亡受抑与肿瘤发生密切相关，如何有效地诱导肿瘤细胞的凋亡成为目前肿瘤治疗的新方向。因此，朱砂七总蒽醌可望成为新的抗肿瘤药物，但朱砂七总蒽醌是如何诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，其凋亡作用受哪些基因调控等尚需进一步深入探讨。

[1] 章静波，张世馥，黄东阳.细胞和组织培养技术[M].北京：人民卫生出版社，2002:253-254.

[2] 司徒镇强,吴军正,刘斌,等.细胞培养[M].西安：世界图书出版社，2004:276-283.

[3] 吴宗群,解建国.对中药朱砂七抗炎及抗溃疡的实验研究[J].齐鲁中医药情报,1992,(31):15-17.

[4] 刘西京，张恩户，郭惠玲,等.朱砂七研究概况[J].陕西中医学院学报,2003,26(3)：62-63.

[5] 赵勤，郭惠玲.朱砂七总蒽醌抗肿瘤的实验研究[J].辽宁中医杂志,2008,35(8)：1222-1223.

[6] 赵勤，郭惠玲.朱砂七总蒽醌对S180、H22、EAC动物移植瘤的影响[J].陕西中医学院学报,2008,31(4)：61-63.

[7] 赵勤，郭玲，胡锐,等.朱砂七总蒽醌抑制HL-60细胞增殖和诱导凋亡的实验研究[J].中药药理与临床，2012,28(5)：66-68.

[8] 赵勤,冯宝平,胡锐,等.朱砂七抗Ⅱ型单纯疱疹病毒的体外研究[J].中药药理与临床, 2012,28(3)：79-81.

[9] 温进坤,韩梅.医学分子生物学:理论与研究技术[M].第2版.北京:科学出版社, 2002:273.