局部应用纤维蛋白凝胶和丝裂霉素预防腰椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连的比较

周 磊 蔡国栋 朱庄臣 王 增 孔德谦王俊勤

(1. 泰山医学院，山东 泰安 271016；2. 泰山医学院附属医院骨科，山东 泰安 271000)

椎管内瘢痕组织增生与粘连形成是导致腰椎手术失败综合征(failed back surgery syndrome，FBSS)的重要原因[1]。因此预防腰椎椎板切除术后瘢痕形成，降低FBSS的发生率具有积极的临床意义。有文献报道纤维蛋白凝胶能有效地预防椎体切除后硬膜外瘢痕粘连的形成。因此，本实验通过建立实验动物模型，比较局部应用纤维蛋白凝胶(FG)和丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)这两种药物预防硬膜外瘢痕粘连的效果。

1 材料与方法

1.1实验动物与主要材料、药品

健康成年雄性SD大鼠 (SPF级，280±20 g，山东中医药大学实验动物中心提供)。丝裂霉素C(MMC)(浙江海正药业股份有限公司)、PBS缓冲液(自行配制)、纤维蛋白胶(FG) 广州倍绣生物技术有限公司提供，商品名为生物蛋白胶等。

1.2实验方法与实验模型制作

SD大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定。取鼠脊柱正中切口长约2 cm，显露Ll、2椎板，切除全L1椎板，形成0.5 cm×0.3 cm缺损，显露硬脊膜，压迫止血，制备L1椎板切除模型。

1.2.148只SD大鼠随机分为3组，每组16只，分别进行标记。

1.2.2药物准备 (1)预先准备好丝裂霉素C、纤维蛋白凝胶(FG)；(2)在无菌条件下配置成浓度为0.1 g/L丝裂霉素C的溶液、0.5ml的纤维蛋白凝胶、生理盐水；(3)术后所有动物在同一条件下按组分笼饲养。

1.2.3观察指标 术后4周取材，后肢功能运动评分(BBB)；评估硬膜与周围组织粘连程度；行HE和Masson染色；成纤维细胞计数；在550 nm波长下检测并计算疤痕组织中羟脯氨酸(HOP)含量。

1.3数据处理及统计分析

2 结 果

2.1伤口愈合情况

所有实验动物术后情况良好，伤口干燥，无伤口感染、红肿、渗液等表现，术后一周伤口愈合，愈合强度良好，无步态异常和死亡。各组实验大鼠用药前BBB评分均为21分，用药后也均为21分 各组大鼠用药后的后肢关节活动 运动幅度步态躯体持续稳定性等各项指标与用药前比较差异均无统计学意义 (P>0.05)。

2.2大体观察

术后4周每组随机抽取8只大鼠对手术段脊柱标本进行局部解剖，剥离硬膜和瘢痕组织，发现所有实验动物伤口愈合良好，未发现伤口有感染和神经损伤表现。根据Rydell分级标准，观察各组硬膜和瘢痕组织粘连情况(见表1)，B组：硬膜后方覆盖一层较薄的粘连，能够比较容易的去除瘢痕组织并暴露出硬膜，分离过程中，出血较少；C组：硬膜与周围组织出现了严重致密的粘连，剥离硬膜的过程中，出血较多，时常出现硬膜撕裂和神经根断裂的现象；A组：瘢痕组织增生较少，硬膜与周围瘢痕组织中间有一潜在间隙，容易剥离，分离过程中极少量出血。

表1 各组术后硬膜外粘连Ryder评分 (n=8)

2.3组织学观察

术后4周将每组剩余的8只大鼠经4%的多聚甲醛灌注后分别取手术节段制作成石蜡标本后分别进行HE和Masson染色。结果：A组：HE染色切片中可见瘢痕组织与硬膜外存在疏松瘢痕组织，与硬膜无明显粘连，少量数目的的成纤维细胞与纤维细胞混杂无炎性细胞(图1)。Masson染色见硬膜外疏松的瘢痕组织，胶原组织增生不明显。胶原含量少，胶原纤维排列规则(图2)；B组：HE染色切片中可见瘢痕组织与硬膜外存在疏松瘢痕组织，与硬膜无明显粘连。成纤维细胞与纤维细胞数量较少，无炎性细胞(图3)。Masson染色见硬膜外疏松的瘢瘦组织，胶原组织增生不明显，胶原含量少，胶原纤维排列规则(图4)；C组：HE染色切片可见瘢痕组织与硬膜粘连紧密，和背部筋膜、肌间隔连成一体，难以区分，大量的成纤维细胞与纤维细胞混杂伴有少量炎性细胞(图5)。Masson染色见硬膜外致密的瘢痕组织，大量的胶原组织增生明显，胶原纤维排列杂乱不规则(图6)。

图1 染色可见瘢痕组织与硬膜外存在疏松瘢痕组织，与硬膜无明显粘连．成纤维细胞与纤维细胞数量较少，无炎性细胞。(×200)

图2 染色可见硬膜外疏松的瘢瘦组织，胶原组织增生不明显，胶原含量少，胶原纤维排列规则。(×200)

图3 染色可见大量的成纤维细胞与纤维细胞混杂伴有少量炎性细胞。(×100)

图4 染色可见硬膜外致密的瘢痕组织，大量的胶原组织增生明显，胶原纤维排列杂乱不规则。(×100)

图5 染色可见瘢痕组织与硬膜粘连仍较紧密和背部筋膜、肌间隔连成一体，含有较多的成纤维细胞与纤维细胞混杂伴有少量炎性细胞。(×100)

图6 染色可见瘢痕组织，大量的胶原组织增生明显．胶原纤维排列杂乱不规则。(×100)

2.4在550nm波长下检测并计算术后4周硬膜外疤痕组织中羟脯氨酸浓度(HOP)、推测胶原含量，其中单纯丝裂霉索组与纤维蛋白凝胶组羟脯氨酸浓度显著减少．与对照组相比P<0.05，具有统计学意义；单纯丝裂霉索组与纤维蛋白凝胶组相比也有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 四组大鼠羟脯氨酸(HOP)含量 (n=8)

2.5成纤维细胞计数

每组切片中成纤维细胞计数见表3 A组和B组切片中成纤维细胞计数与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05) ；A组与B组相比也具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组切片中成纤维细胞计数(n=8)

3 讨 论

硬膜外成纤维细胞及其基质的增生是引起脊柱术后再次发生疼痛症状的主要原因[2,3]。通过解剖发现，手术后早期即在手术区域出现血肿，在随后的2～4周内，血肿则被一层厚厚的、白色纤维结缔组织所取代。成纤维细胞最初来源于竖脊肌的肌肉组织，随后进入连同毛细血管进入血肿内，并最终入侵到椎管内，分泌基质，引起强烈的组织粘连。

丝裂霉素C能够渗透到手术区域周围，目前广泛地应用于防止伤口疤痕的形成。丝裂霉素化学结构具有苯醌、乙酰亚胺基及氨甲酰三个活性基团，作用与烷化剂相似，与DNA链形成交联，抑制DNA复制，对RNA也有抑制作用，属细胞周期非特异性药物，它是目前药物抗粘连作用较强的一种。前期有学者研究表明在椎板切除术后，硬膜外局部湿敷丝裂霉素后，抗粘连效果良好，其作用已得到公认，并广泛应用于治疗青光眼滤过术中[4]，并在耳鼻喉科常规治疗耳鼻部皮肤瘢痕喉腔狭窄等，近年来曹晓建等[5]的一系列的研究表明MMC能有效防止硬膜外粘连纤维蛋白凝胶是一种高分子物质，一方面它是一种具有多向生物活性生物蛋白，能迅速形成立体网状结构，起到良好止血和屏障作用。另一方面，由于它在体内能够快速的降解，不易引起细菌感染。局部注射可以形成凝胶圈起到封闭和粘合作用；还能够充当生物基质应用于骨和软组织工程。有学者[6,7,8]认为它的类似于细胞膜的特性,还有助于保护神经细胞的功能，同时FG所形成的分子屏障还可以防止血小板的聚集，减少血小板和白细胞聚集于手术创面，植入后随着被机体的吸收，在硬膜后方与竖脊肌问形成一较小的间隙，也减轻了粘连的程度。

本实验中FG组硬膜外瘢痕粘连易于分离，钝性分离时仅有少量出血，且没有硬膜囊撕裂的现象，瘢痕中HOP含量也低于对照组，组织学观察进一步显示仅有少量粘连，成纤维细胞计数也明显低于对照组，这些结果都提示FG能有效减少椎板切除术后硬膜外粘连。而MMC组硬膜外瘢痕粘连稀疏，更易于钝性分离，且没有出血，瘢痕中HOP含量，组织学观察的成纤维细胞计数低于FG组和对照组。

综上所述在本实验中采用定性和定量的方法对比了局部应用相同剂量的MMC和FG预防硬膜外粘连的效果，结果显示两者都可以预防硬膜外瘢痕粘连，但是形态学观察、HOP含量组、织学观察、成纤维细胞计数差异均有统计学意义，MMC预防硬膜外瘢痕粘连的效果优于FG这可能与是一种细胞周期非特异药物有关，它能够抑制处于各个周期的成纤维细胞，从而减少硬膜外瘢痕粘连。如果能合理应用，局部应用MMC可作为脊柱外科降低FBSS的一个新方法。

[1] 赵继军, 李正维, 杨述华．椎板切除术后早期进行直腿抬高运动对硬膜外纤维化影响的实验研究[J].中国矫形外科杂志, 2006,14(19):1494-1496．

[2] 王 婷，张杰.丝裂霉素 在治疗喉气道再狭窄中的应用[J]临床肺科杂志，2010，15(3 ) :386-387

[3] Su C, Yao C, Lu S, et al, study on the optimal concentration of topical mitomycin C in preventing postlaminectomy epidural adhesion[J]. Eur J Pharmacol,2010, 640(1-3):63-67.

[4] 陈毓东,王映芬,莫百军．丝裂霉素C抗人翼状胬肉成纤维细胞增殖的实验研究[J].眼科研究,2001,19(1):39-41．

[5] 曹晓建，王立新.7．0TMicro MRI观察丝裂霉紊C预防硬膜外粘连的效果研究(J).南京医科大学学报，2008,28(10):1263-1266

[6] 皮国富, 徐宏辉, 刘宏建. 医用生物蛋白胶预防腰椎椎板切除术后硬膜外粘连的观[J].医药论坛杂志, 2009, 30(16):109-110.

[7] Chou SF, Chang SW, Chuang JL．Mitomycin C upregulatesIL-8 and MCP-1 chemokine expression via mitogen-activated protein kinases in corneal fibroblasts[J]. Invest Ophtha- lmol Vis Sci,2007,48:2009-2016．

[8] 李小磊, 颜连启, 王静成，等. 局部应用他克莫司和丝裂霉素预防腰椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连的比较[J]. 临床骨科杂志. 2012, 15 (5):564-566.