抗血小板药物治疗监测的进展

乔 蕊，张 捷

(北京大学第三医院检验科，北京100191)

抗血小板药物在动脉粥样硬化导致的血栓事件一级预防和二级预防中发挥着重要的作用。但是与降压药、降糖药和降脂药不同，临床目前一般不根据抗血小板治疗的效果而调整抗血小板药物剂量。近年来，这种给予固定剂量的抗血小板药物而不常规监测血小板抑制程度的做法受到挑战。实验室研究结果证明阿司匹林和二磷酸腺苷(ADP)受体拮抗剂(如氯吡格雷)存在广泛的个体间差异［1-2］。前瞻性观察研究提示阿司匹林和氯吡格雷的低反应性与不良心血管预后有关。初步的数据提示根据血小板试验调整氯吡格雷剂量可以改善临床预后［3-4］。因此重视发展安全有效的抗血小板治疗的监测手段可能将非常有意义。

一、抗血小板药物的机制

见表1和图1。

表1 抗血小板药物和机制

图1 抗血小板药物的机制

二、血小板功能试验

血小板功能试验可以测定每个患者血小板激活达到的程度。我们主要探讨在心血管疾病背景下，目前用于监测抗血小板治疗和预测血栓形成及出血的血小板功能试验。

(一)血小板功能试验

1.血小板聚集仪 血小板聚集仪的重复性受到很多因素的影响，包括采集试管内柠檬酸钠浓度、血小板计数的调整情况、样本保存时间、搅拌珠速率、温度及血样本的pH值等。比浊法血小板聚集测定是目前实验室测定血小板功能广泛使用的方法。该方法需要制备富含血小板的血浆(乏血小板血浆作为对照)，需要使用ADP、肾上腺素、胶原、花生四烯酸和瑞斯托霉素等引发聚集反应。该试验通过测定加入诱导剂后，以整联蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依赖的血小板聚集引起的透射光变化来反应血小板的功能。优点:虽然方法设计之初是用于血小板功能缺陷检测而不是用于预测血栓形成，但是仍是传统的测定血小板功能的“金标准”方法。缺点:制备富含血小板血浆需要离心，可能导致血小板提前激活。电阻法血小板聚集测定被推荐作为比浊法的备选方法。该方法使用全血样本测定，同样以整联蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依赖的血小板聚集形成为检测基础。优点:不需要制备富含血小板的血浆，使用全血检测，更具有生理学优点。缺点:检测耗时长，费用高，通量低，不适合大量样本检测。

2.流式细胞术 流式细胞术虽然一般不进行常规检测，但其可增强检测止血潜能和血小板抑制治疗反应的诊断能力。流式细胞术使用全血样本进行检测，而且必须迅速检测以保持全血的“生理”环境。血小板表面的P选择素、活化的整联蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)和白细胞-血小板聚集体可通过流式细胞术测定［6］。整联蛋白αⅡbβ3一般以静息构象在血小板表面表达。随着血小板激活，其构象会发生改变，只有特异性的单克隆抗体血小板相关补体-1(PAC-1)可以与这种激活构象结合。因此，PAC-1阴性的血小板是静息状态的血小板，PAC-1阳性的血小板是活化的血小板。血小板被激活后发生脱颗粒，同时P选择素(一般表达于α颗粒膜表面)外化表达在血小板的表面［7-8］。因此，P选择素阴性的血小板是静息状态的血小板，P选择素阳性的血小板是活化的血小板。而且P选择素阳性的血小板可以迅速的与白细胞表面的P选择素糖蛋白(glycoprotein，GP)配体结合形成白细胞-血小板聚集体。循环中的白细胞-血小板聚集体(特别是单核细胞-血小板聚集体)是比循环中P选择素阳性的血小板更敏感的体内血小板活化的标志物。优点:采用全血测定，需要的样本量很少。可在标本固定后运往中心实验室检测，适用于多中心的临床试验［7］。缺点:检测前样本前处理复杂，设备(流式细胞仪)昂贵，对检测技术人员的经验要求高。因此，这种方法目前主要用于科研研究。活化舒血管磷蛋白(VASP)的磷酸化可通过商品化的试剂盒(BIOCytes，Marseilles，France)检测［6］。这是一个对P2Y12拮抗剂作用特异的血小板功能检测方法。如图2所示，前列腺素E1与其血小板表面的磷酸肌醇受体结合，信号通过激活性G蛋白和AC将ATP转化成环磷酸单腺苷，然后通过蛋白激酶A将VASP转化成磷酸化的 VASP(VASP-P)［9］。VASPP调节GPⅡb/Ⅲa受体的活化。ADP与血小板表面的P2Y12受体结合，信号通过抑制性G蛋白抑制前列腺素E1诱导的AC信号的传递。P2Y12拮抗剂(例如氯吡格雷的活化代谢产物)能抑制这种ADP诱导的效应。因此，当前列腺素E1和ADP同时存在时，VASP-P与P2Y12拮抗的程度成比例。VASPP可使用透膜技术和对VASP-P特异的单克隆抗体进行测定。优点:VASP试验以 P2Y12为特异靶目标，采用全血测定，所需样本量少。而且，柠檬酸抗凝的全血样本可以在室温条件下，运送至中心实验室检测，非常适用与多中心的临床试验研究。缺点:样本制备复杂，设备(流式细胞仪)昂贵，测定技术人员经验要求高。

3.血栓弹力图(TEG)TEG发明已有50多年，但是近年来才更新改造成TEG血小板图记系统 (TEG platelet mapping system，Haemoscope，Niles，IL)［10］。该试验测定血栓形成和溶解的动力学特性，定量测定ADP或花生四烯酸激活的血小板聚集对血凝块形成的作用。优点:除采用全血测定外，主要优点是在测定血小板功能的同时，可以特异的测定血小板对凝血块形成的贡献。缺点:需要样本前处理，检测时间长，结果解释需要专业人士，有关研究有限。

4.血栓烷测定 血栓烷A2在血小板激活的过程中释放，并且很快代谢成稳定的血栓烷B2，血栓烷B2可在血清或血浆中被检测到。优点:测定血栓烷B2旨在测定阿司匹林抑制COX-1的效应。缺点:测定血清/血浆中的血栓烷B2并不是直接的测定血小板的试验，因此特异性差。尿11脱氢血栓烷B2是血栓烷A2在尿液中稳定的代谢形式，可被检测到。优点:测定尿液中的11脱氢血栓烷B2旨在测定阿斯匹林抑制COX-1的效应。缺点:不是直接的测定血小板的试验，特异性差。肾功能对该试验有影响。

图2 VASP-P试验特异检测P2Y12拮抗剂的抗血小板作用

(二)即时检验(POCT)和仪器

POCT由于具有很多潜在的优点，因此越来越得到临床的重视。首先，POCT可以快速、可靠地评估止血潜能和治疗反应;其次，仅需简单的培训、试剂处理、定标和一定的空间即可进行检测;第三，这些新兴的技术可能将成为凝血和血小板试验有力的补充，可用于家中、流动门诊、急诊、血管成形术中心、冠心病监护病房和手术室的监测管理。目前临床可供使用的检测血小板功能的POCT试验见表2。

1.VerifyNow VerifyNow(accumetrics，san diego，CA)以整联蛋白 αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依赖的血小板聚集为基础［11］，是一种完全自动化的POCT。其试剂仓包含血小板激活剂和纤维蛋白原包被的珠子(血小板的聚集可以通过纤维蛋白原包被的的珠子被放大)。全血样本直接装载检测，血小板的激活通过透光率来监测。

2.Plateletworks Plateletworks(helena laboratories，beaumont，TX)也以整联蛋白 αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)依赖的血小板聚集为基础。在枸橼酸抗凝的血液中加入ADP或者胶原，诱导血小板聚集，然后测定血小板计数，通过与乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的对照管中的血小板计数比较，来反应血小板的活化能力［10］。

3.Impact cone and Platelet analyzer Impact cone and Platelet analyzer(DiaMed，Cressier，Switzerland)以剪切力诱导的血小板黏附聚集为终点。该试验通过在高剪切力(1 800 s-1)条件下，监测血小板黏附聚集在一种塑料盘上的能力，来反应血小板的功能。剪切力对于血小板的功能非常重要［12］，特别是在冠状动脉疾病(CAD)中。Impact analyzer可以调节剪切力，与CAD中的剪切力相关。

4.血小板功能分析仪-100(PFA-100)PFA-100是在高剪切压力条件下模拟初期止血的试验。依靠毛细管虹吸作用，柠檬酸盐抗凝的全血通过胶原和肾上腺素或胶原和二磷酸腺苷包被的一个膜，膜上的孔隙在血小板黏附聚集后会被堵塞，试验结果即为孔隙的被封闭时间。

三、监测抗血小板治疗的方法

(一)监测阿司匹林治疗

检测血小板功能的试验众多，何种方法适用于阿司匹林抗血小板治疗的监测呢?见表3。

表2 检测血小板功能的POCT试验

表3 可用于监测阿司匹林治疗的试验［14］

1.血清/血浆血栓烷B2和尿11脱氢血栓烷B2可被用于终点检测。阿司匹林特异性的抑制血小板的COX-1，因而抑制血栓烷的产生。但是所有服用阿司匹林的患者都会被检为COX-1被抑制，因此这2个试验缺乏临床特异性。

2.花生四烯酸被用作激活剂。花生四烯酸可以特异的诱导传递至COX-1(阿司匹林的抑制位点)的信号通路。但是阿司匹林抑制血小板的效应可能并不全因抑制COX-1导致［13］。以花生四烯酸作为诱导剂，许多试验可被选择用于阿司匹林抗血小板治疗的监测。见表3。

3.PFA-100已被广泛的用于研究阿司匹林抑制血小板的反应性。但是与前2种方法不同，PFA-100不是COX-1特异的。

(二)监测氯吡格雷的血小板功能试验

有2类，见表4。

表4 监测氯吡格雷抗血小板作用的血小板功能试验［14］

1.VASP-P试验 只有VASP-P试验对P2Y12受体信号通路特异。

2.ADP作为诱导剂的血小板功能试验 需要注意ADP既与P2Y1受体结合也与P2Y12受体结合，而氯吡格雷的代谢活性物只与P2Y12受体结合。因此ADP诱导的血小板反应，既包括氯吡格雷抑制 P2Y12受体的效应，还包括 ADP激活P2Y1受体的效应。

(三)监测GPⅡb/Ⅲa拮抗剂的血小板功能试验

有2类试验。第一类，GPⅡb/Ⅲa拮抗剂阻滞了血小板聚集的最后共同通路，可通过很多血小板功能试验监测，见表5。第二类，没有整联蛋白αⅡbβ3(GPⅡb/Ⅲa)的构象变化，血小板聚集就无法发生。因此采用流式细胞仪通过单克隆抗体PAC-1或配体诱导的结合位点测定血小板表面活化的GPⅡb/Ⅱa受体的变化也可以起到监测作用。

表5 监测GPⅡb/Ⅲa拮抗剂抗血小板作用的血小板功能试验

(四)需要监测血小板功能的情况

在以下情况下可能需要监测血小板功能，见表6。

表6 临床中可能需要监测血小板功能的情况

(五)理想血小板功能抑制水平

由于血小板检测的是血小板的功能，而不是单一的物质，所以血小板功能的检测方法不可避免的存在很大的变异。加之不同检测方法的原理差异，检测结果的单位也完全不同。所以不同方法之间的可比性仍是一个很大的问题。针对理想血小板抑制水平的研究，除了方法变异大的局限性外，仍缺乏大规模的前瞻性研究，而且不同研究之间的结果差异也较大［15-16］。目前不同实验室使用理想血小板功能抑制水平大都是基于本实验室的方法和服务人群的基础上建立的。

四、小结与展望

由于血小板在动脉血栓形成起始步骤中的作用已被认识，所以在心血管事件一级预防和二级预防中血小板成为主要的抑制目标。传统上，血小板活性测定一直被认为是一种诊断工具，用来评估出血性患者。然而，更快捷的、能迅速测定血小板性能的技术也为血栓形成前状态的决策治疗创造了机会。但是由于缺乏充分的循证医学证据，依据血小板功能检测结果调整抗血小板药物剂量的指南和临床预后仍处于缺乏状态。

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