两种培养方法检测解脲脲原体及其菌落形态学的比较研究

周运恒，马红霞，曹广亚，石晓星，刘风华

(1.警上海市总队医院检验科，上海201103;2.上海市东方医院体验中心，上海200120)

解脲脲原体(ureaplasma urealyticum，Uu)是泌尿生殖道感染较为常见的病原微生物之一，在特定的条件下可以致病，可引起非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)、宫颈炎、前列腺炎、不孕不育症等，其致病性与宿主免疫力、Uu的血清型或基因型等因素有关。目前Uu检测主要是采用液体培养法，已经沿用近20年，但在临床中已暴露出很多缺陷，如假阳性率高［1］、假阴性以及污染干扰严重［1］等。固体琼脂法可以观察支原体特征性的菌落，如“海胆型”或“油煎蛋样”菌落是微生物学诊断的金标准。但由于操作烦锁、培养时间长以及试剂有效期短等原因，目前国内外临床上仅有少数医院在应用，且支原体形态和菌落较难辨认，所以对Uu形态学的研究较少。本研究采用选择性固体培养基-液体培养基一步法比较2种培养方法检测Uu结果的差异，并观察男女不同类型标本中Uu菌落形态学的差异。

材料和方法

一、材料

1.研究对象 2011年3至9月武警上海市总队医院门诊妇科、皮肤科、不育不孕科及泌尿外科就诊患者共1 698例。其中，女性宫颈分泌物标本1 030例，男性尿道分泌物标本156例，精液标本512例。

2.试剂 支原体液体培养基由郑州安图绿科生物工程有限公司提供，Uu选择分离培养基由河北微拉生物科技有限公司提供，用OLYMPUS CR21显微镜观察并拍照。标准菌株为Uu(ATCC 27813)，由郑州安图绿科生物工程有限公司提供。

二、方法

1.标本采集 男性患者的尿道拭子:消毒尿道口后自行由内向外挤压阴茎数次，用无菌小棉拭子蘸取无菌生理盐水少许轻轻插入尿道口1～2.5 cm处，360°轻转3～5圈蘸取分泌物，将取样后的棉拭子插入专用无菌试管中。精液:按照常规方法取出，禁欲3～7 d后手淫或取精器取精液于干燥消毒量杯内(收集标本前排尿，并用无菌水清洗尿道口)，置37°C水浴箱内液化。女性患者:采样前3 d内未使用阴道内药物或冲洗阴道，24 h内无性行为，避开月经期采集;采集时常规消毒外阴，用阴道窥器扩张后，先用无菌棉球清除宫颈口分泌物，另取小棉拭子蘸取无菌生理盐水少许插入患者宫颈口1～2 cm处单层柱状上皮细胞，360°轻转3～5圈，停留片刻取出，放入配套的无菌容器中，立即送检。

2.直接接种法 将取材后的拭子或液化后的精液在固体选择分离培养基表面涂抹接种，并放入CO2发生片;然后接种分泌物标本或液化后的精液于支原体基础培养液中，在37℃孵箱内培养。所有操作步骤均严格按照说明书进行。

3.结果判断 液体培养基判断标准:培养48 h，液体培养基由黄色变成红色和橙红色，凡≥104CFU/mL鉴定孔试剂变色为Uu阳性的筛选对象，＜104CFU/mL为携带者或无致病意义。固体培养基阳性判断标准:培养48 h，用显微镜在低倍镜下观察固体培养基支原体的菌落生长情况，以看到固体培养基上生长的支原体菌落(如“海胆型”或“油煎蛋样”等)作为阳性的确诊标准，形态学可疑时可以延长培养至72～168 h再观察。一般情况下，Uu菌落较小，圆形，棕褐色;人型支原体菌落较大，无色，有宽大透明周边带环绕的油煎蛋样。

三、统计学方法

数据用 SPSS 15.0软件进行 χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、支原体感染阳性率

液体培养法与固体培养法相比，女性宫颈分泌物标本Uu阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)，而男性精液和尿道分泌物标本Uu阳性率之间差异无统计学意义(P＞0.05)。以固体培养法为标准判断，发现女性生殖道分泌物标本的Uu阳性率最高(49.9%)，明显高于男性精液和尿道分泌物标本(P均＜0.05)。见表1。

表1 2种方法培养不同类型标本支原体阳性率结果

二、固体培养基上不同类型标本支原体形态学观察

Uu菌落存在多形性，主要的菌落形态有:海胆型(形似海胆，棕黑色，圆形或不规则形，大小不等，内部有布纹样结构，单个或多个菌落聚集在一起)、油煎蛋型(形似油煎蛋，棕黄色，圆形，核心颗粒致密)、空泡型(边缘颗粒致密呈棕黑色，内部无色疏松)、微小型(菌落较小，棕黑色)、棒状(棕黑色，长短、粗细不等)，而且同一种菌落在不同类型标本中其菌落大小和数量等方面也不完全一致。见图1、图2。

三、不同类型标本Uu菌落形态分布

在3种不同类型标本中，Uu菌落形态均以海胆型菌落为主(77.5%)，其次是油煎蛋样(13.8%)，而微小型、空泡型和棒状较少见，另外存在2种以上形态的混合型菌落。见表2。

图1 女性宫颈分泌物中Uu形态(×100)

图2 精液标本中Uu形态(×100)

表2 不同类型标本Uu菌落形态分布

讨 论

传统的支原体分离培养过程应有2个部分，肉汤增菌和滤液转种，观察其菌落形态，然后进行Diense染色和生化反应最终报告。但间接转种法由于转种的时间选择不当也存在一定的假阴性。由于固体培养法操作和观察结果繁琐，在上海地区几乎没有医院采用固体培养法，而且有的液体培养法不做定量计数和药物敏感性试验。据吴磊等［2］报道在2008年上海市共有124家临床实验室参与Uu室间质控，结果显示Uu阳性标本、干扰菌和阴性模拟物3种标本均符合的只有39家，可见试剂质量参差不齐。本研究采用的是一步培养法，与传统的二步法相比可以节约时间，减少工作量，而且操作方便，利用划痕能容易在琼脂层表面找到支原体菌落［3］。一些小样本研究发现固体培养法与液体培养法相比在阳性率结果方面存在争议，而且多以女性的标本为主，没有按照标本类型分别研究［4-5］。我们通过1 698例大样本研究发现在检测女性Uu阳性率时，液体培养法的阳性率要高于固体培养法，而对于男性标本，两者差异无统计学意义。可能是由于男、女性泌尿生殖道Uu寄存环境的差异，一步法与两步法假阴性的差异以及试剂厂商不同、抑制细菌的能力和检测率差异所致。

本研究发现，液体培养法存在较高的假阳性，尤其是女性宫颈分泌物标本，男性精液和尿道分泌物标本液体培养法虽然也存在一定的假阳性，但与固体培养法相比差异无统计学意义。主要原因可能是男女生殖道寄居或感染分解尿素的细菌不同所致［6］。另外标本中某些酵母菌和葡萄球菌的污染以及碱性标本也是液体培养法假阳性增加的原因。据曹爱国等［7］研究报道，液体培养基的假阳性率在20%左右。我们发现有6.3%(65/1 030)的女性患者Uu液体培养法结果仅阳性对照孔变色或半定量结果≤104CFU/mL，但在固体培养基上可以观察到典型的支原体菌落。这种假阴性可能是:标本分泌物量少或接种量少、标本未及时接种而引起支原体死亡以及不分解尿素的支原体存在所致。

本研究女性宫颈分泌物标本中Uu感染率(49.9%)明显高于男性精液(39.6%)，与夏晴晴等［8］报道的女性生殖泌尿道支原体的感染率基本一致。这可能与男性寄居或感染的菌株型别不同，女性的生理解剖学特殊而更易感染Uu，或者是与女性到医院的就诊率较高有关。男性精液感染率较高，可能与患者多来自不孕不育科有关，而不育不孕症患者Uu阳性率要显著高于一般人群［9-10］。而男性尿道分泌物中 Uu感染率最低(19.2%)，明显低于文献中报道的感染率，可能与患者类型、分泌物标本量少直接影响结果有关。由于尿道感染支原体容易治愈，而前列腺和附睾感染的支原体不容易治愈，因此李志军等［11］建议男性泌尿生殖道感染的首诊和复查患者宜采用精液检测支原体，不容易漏诊。

文献和教科书中一般认为Uu的菌落形态是海胆型或油煎蛋样。本研究中Uu主要是以典型的海胆型菌落为主，也存在油煎蛋样、空泡型、微小型、棒状和混合型等其他不同形态。这种异质性的主要原因是由于不同菌株生长特性和生化反应的差异导致菌落数量和形态学的差异。Uu根据分子生物学特征被分成14个血清型或2个生物群［12］。另外不同标本中因支原体含量的差异，培养基营养成分和培养条件如气压、湿度的不同而呈多形性［13］。潘展砚等［14］观察了99例 Uu菌落，发现主要菌落形态为海胆型，形态的异质性与细菌性阴道炎致病性有关。我们在临床上发现男女Uu菌落形态学存在一定的差异，可能主要是由于Uu寄生的环境生物学特性差异以及寄居在男女生殖泌尿道的Uu的型别不同所致［15-17］。

因此，固定培养基和液体培养基联合检测，观察培养基颜色变化和菌落特征，可以提高Uu检测的特异性和敏感性，降低假阳性率和假阴性率，更好地为临床诊治提供客观的依据。但是2种培养方法的共同缺点是耗时长，不利于疾病的快速诊断和治疗，而且不能对支原体进行分型，尤其是固体培养法操作较烦锁，今后可将标本类型、菌落形态学与基因分型结合起来，通过大批量样本来系统研究不同类型的Uu与致病性或耐药性的关系，对于Uu感染的流行病学调查、诊断与防治将具有更重要的意义。

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