沉默AFP基因可抑制肝癌HepG2细胞Survivin mRNA的表达*

方 念 方紫凌 张慧卿 韩小妮 黄 根 王农荣 熊建萍 张焜和

甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），作为血清标记物已广泛应用于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的临床诊断、治疗及预后判断［1］。近年研究表明，AFP在HCC的细胞增殖和凋亡中发挥重要作用［2-3］。Survivin是近年发现的凋亡蛋白抑制因子家族成员，其最显著的特点是仅在各种肿瘤中表达，而在正常分化组织中沉默，是当今研究的热点之一［4］。研究表明，肝癌组织中Survivin呈高表达状态，是独立的预后不良因素［5］。目前，肝癌细胞AFP与Survivin之间调控关系的研究，国内外鲜有报道。本研究以肝癌细胞HepG2为研究对象，通过RNA干扰技术沉默AFP，检测细胞凋亡和Survivin基因表达的变化，以探讨肝癌AFP基因靶向RNA干扰治疗的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基购自美国GibcoBR公司；胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供；Lipofectami-neTM2000转染试剂购自美国绿阳公司；AFP定量测定试剂盒（ELISA）由郑州安图绿科生物工程有限公司提供；AFP基因的RNA干扰系列和相关引物由上海生工生物工程公司设计与合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肝癌细胞株HepG2细胞由南昌大学消化研究所惠赠，将细胞生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，接种于37℃，5%CO2，饱和湿度的孵箱中培养。

1.2.2 实验分组 本研究实验细胞共分为3组，即实验组、脂质体+空质粒对照组和空白组。

1.2.3 ELISA法测定HepG2细胞上清液AFP 接种培养HepG2细胞，分别收集转染前和转染后12、24、48 h的细胞培养上清液，3 000 rpm，4℃离心10 min，取上清液。按照试剂盒说明书操作，采用ELISA法检测AFP含量。

1.2.4 siRNA沉默HepG2细胞AFP基因 1）本研究选取的AFP siRNA目的基因片段：5'-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3'，送上海生工设计、合成干扰系列和引物。上游引物系列：5'-AAA TAC ATC CAG GAG AGC CA-3'，下游引物系列：5'-CTG AGC TTG GCA CAG ATC CT-3。2）构建载体：参照亓同钢等［6］报道的方法构建AFP基因siRNA表达质粒。3）质粒转染：取对数生长期的HepG2细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，用不含血清、抗生素的RPMI 1640培养基将细胞重悬。每组设立3个复孔，加质粒和经稀释的LipofectamineTM2000转染复合物，室温孵育4 h，于12 h和24 h更换培养基，48h收获细胞。

1.2.5 细胞增殖与凋亡的检测 1）MTT法检测HepG2细胞增殖：收集转染前和转染后12、24、36、48 h的HepG2细胞，每组设9个复孔，每孔终体积为200 μL，每孔内加入20 μL MTT溶液（3 g/L），将细胞移入培养箱继续培养6h。吸去培养基，每孔内加入150 μL DMSO，振荡摇匀，用酶标仪于490 nm波长条件下测定吸光度值。2）AnnexinⅤ-FITC/PI双染色流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡：收集转染前和转染后12、24、48 h HepG2细胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化、收集总细胞，PBS洗涤2次，弃上清。加入400 μL结合缓冲液使细胞重悬，再加6 μL Annexin V-FITC，4 μL PI，室温避光孵育15 min。采用激发波长488 nm，分别以红色和绿色荧光通道检测细胞凋亡。

1.2.6 逆转录-PCR检测Survivin基因 采用RT-PCR半定量检测各组转染前后Survivin基因的表达，收集各组转染前和转染后12、24、48 h的HepG2细胞，以合成的Survivin基因特异性引物进行扩增。上游引物系列：5'-CCG CAT ACA GTG GTC GAG AGA-3'，下游引物系列：5'-GTG TAG GGT GTA GAA TCC TGT TCA-3'。

2 结果

2.1 转染前后各组细胞上清液AFP水平

采用ELISA法检测HepG2细胞上清液AFP浓度，所得结果（表1）。

表1 转染前后肝癌细胞培养上清液中AFP的浓度（ng/mL）Table1 AFP level in the supernatant of hepatocellular carcinoma HepG2 cells

2.2 AFP siRNA转染后HepG2细胞生长活力下降

收集经转染后12、24、36、48 h的HepG2细胞，采用MTT法检测细胞活性（图1），结果发现转染24 h和48 h后转染组与对照组间有显著性差异（P＜0.01）。

图1 MTT检测AFP siRNA转染后HepG2细胞增殖Figure1 Effects of AFP siRNA on HepG2 cell proliferation detected by MTT assay

2.3 AFP siRNA转染后HepG2细胞凋亡增加

本研究检测了转染AFP-siRNA 48 h后，各组HepG2细胞的凋亡率。结果发现转染组AFP-siRNA的细胞凋亡率为35.6%，较转染前增加了24.3%。阴性对照组和空白组细胞凋亡率分别为12.5%和11.3%，实验组细胞凋亡率较阳性对照组和阴性对照组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05，图2）。

2.4 HepG2细胞AFP siRNA对Surivivin基因表达的影响

收集12、24和48 h后转染组与对照组细胞，经基因扩增，UV凝胶图像分析仪分析电泳结果，AFP-siRNA转染24、48 h后Survivin mRNA较转染前减少59%、78%。HepG2细胞上清液AFP水平与HepG2细胞Survivin-mRNA表达的变化具有较强的一致性（图3）。

图2 转染AFP-siRNA-48 h后HepG2细胞凋亡率Figure2 Effects of AFP siRNA on HepG2 cell apoptosis

图3 AFP-siRNA转染后AFP和Survivin mRNA表达的变化Figure3 Changes in AFP and Survivin mRNA expression after AFP-siRNA silence

3 讨论

由于大量慢性乙型肝炎感染人群的存在，原发性肝癌仍是我国高发的重大疾病［7］。近年来，肝癌的治疗效果有所提高，其主要原因之一是以AFP为基础的血清学检测技术以及结合现代影像技术的进步，提高了肝癌的早期诊断率，进而提高了肝癌患者的早期处理比例［8］。AFP广泛应用于HCC的诊断、监测和随访，但其生物学功能直到近来才引起人们注意。大量研究证实，AFP具有复杂的生物学功能，如促进肝癌细胞增殖、抑制凋亡和免疫逃避［2，9］。

本研究通过小RNA干扰技术沉默肝癌HepG2细胞中AFP基因的表达，结果显示，在转染48 h后，肝癌细胞培养上清液中AFP的浓度明显下降［由（988.45±12.58）ng/mL降至（154.23±7.78）ng/mL］，与对照组相比有显著差异，提示转染成功。转染48 h后，实验组肝癌细胞生长被抑制43.04%，而细胞凋亡率则增加24.3%，即沉默肝癌细胞AFP基因的表达后，细胞增殖降低，细胞凋亡增加，这与Yang等［3］报道的结果相似。

Survivin是一种凋亡抑制蛋白（inhibition apoptosis protein，IAP），在除甲状腺、胸腺及生殖腺以外的分化成熟的成人组织中表达缺失，而在绝大多数肿瘤组织中表达阳性，这种表达特性使其迅速成为恶性肿瘤诊断与治疗研究的新靶点。研究表明，Survivin在肝癌细胞高表达，调控着细胞的分裂、增殖和凋亡［10-11］。

如前所述，我们通过RNA干扰下调肝癌HepG2细胞AFP基因表达之后，肝癌细胞的凋亡率增加。本研究还观察到在转染的过程中，随着培养上清液AFP浓度的持续下降，Survivin mRNA的水平也逐渐降低，两者表现出较好的一致性。因此，我们推测细胞凋亡率的变化可能与Survivin的表达下降相关，即沉默AFP基因能抑制Survivin表达，进而促进凋亡。与我们的报道相符，Li等［12］在Bel7402细胞的研究中发现，通过AFP抗体抑制AFP的表达后Survivin水平明显降低，肝癌细胞凋亡效果加强，同时认为AFP通过上调Survivin的表达来抑制TRAIL诱导凋亡的活性。

AFP在肝细胞癌的发生、发展中发挥重要作用，通过本研究表明，通过RNA干扰技术阻断AFP表达，对于控制AFP阳性HCC的发展及术后复发可能具有重要价值。

1 Debruyne EN,Delanghe JR.Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma with alpha-fetoprotein:new aspects and applications[J].Clin Chim Acta,2008,395(1-2):19-26.

2 Li M,Li H,Li C,et al.Alpha fetoprotein is a novel protein-binding partner for caspase-3 and blocks the apoptotic signaling pathway in human hepatoma cells[J].Int J Cancer,2009,124(12):2845-2854.

3 Yang X,Zhang Y,Zhang L,et al.Silencing alpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis in human hepatocellular cancer cell[J].Cancer Lett,2008,271(2):281-293.

4 Chau GY,Lee AF,Tsay SH,et al.Clinicopathological significance of survivin expression in patients with hepatocellular carcinoma[J].Histopathology,2007,51(2):204-218.

5 Yang Y,Zhu J,Gou H,Clinical significance of Cox-2,Survivin and Bcl-2 expression in hepatocellular carcinoma(HCC)[J].Med Oncol,2011,28(3):796-803.

6 亓同钢,汪运山,王 芳,等.AFP基因siRNA表达质粒的构建及鉴定[J].山东大学学报,2004,42(3):353-354.

7 郑荣寿,张思维,吴良有,等.中国肿瘤登记地区2008年恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2012,21(1):1-12.

8 吴孟超.原发性肝癌的诊断及治疗进展[J].中国医学科学院学报,2008,30(4):363-365.

9 Um SH,Mulhall C,Alisa A,et al.Alpha-fetoprotein impairs APC function and induces their apoptosis[J].J Immunol,2004,173(3):1772-1778.

10 Zhu H,Chen XP,Zhang WG,et al.Expression and significance of new inhibitor of apoptosis protein survivin in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2005,11(25):3855-3859.

11 Zhao X,Ogunwobi OO,Liu C.Survivin inhibition is critical for Bcl-2 inhibitor-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells[J].PLoS One,2011,6(8):e21980.

12 Li M,Zhou S,Liu X,et al.alpha-Fetoprotein shields hepatocellular carcinoma cells from apoptosis induced by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Cancer Lett,2007,249(2):227-234.