抑制JNK信号通路下调A549中LRP表达可增强顺铂化疗敏感性*

傅应亚 韩晓黎 黎友伦

肺癌是绝大多数国家恶性肿瘤死亡的首要原因。肺癌中约80%为非小细胞肺癌，病死率高。顺铂是目前肺癌化疗的一线推荐药物，其抗肿瘤作用已得到肯定，但极易形成耐药，故限制了它的应用。因此，如何提高化疗敏感性、减少耐药以提高疗效、延长患者生存期已成为近年来肺癌临床治疗急需解决的问题之一。

细胞内药物蓄积减少是肺癌顺铂耐药分子机制之一。肺耐药蛋白（lung resistance protein，LRP）是Scheper等［1］在P-gp（p-糖蛋白）阴性的多药耐药性肺癌细胞系SW-1573/2R 120中发现的一种高表达的蛋白。LRP是一种穹窿体蛋白（major vault protein，MVP），主要存在于核膜和胞浆囊泡，参与药物进出胞核及囊泡运输。因此，LRP通过阻止药物进入胞核，把胞浆的药物运入囊泡，通过胞吐作用排出，导致细胞内药物蓄积减少，诱导耐药。研究发现，LRP在肺癌组织中高表达，且与肺癌细胞分型、吸烟、化疗耐药等有关［2］。用顺铂、阿霉素、博莱霉素分别短期处理肺癌细胞株，均可使细胞LRP mRNA表达增高，而仅顺铂的化疗反应性和LRP mRNA表达水平之间存在显著相关性。Osborn等［3］认为JNK信号通路是细胞应答抗癌药物的重要组成成分，可能在化疗耐药中起着重要的作用。Levresse等［4］研究发现铂类药物可促使JNK持续活化及下游c-jun的表达，从而减少药物引起的凋亡，抑制JNK的活化可以增加小细胞肺癌的药物敏感性。

由此可知，抑制JNK的活化可增强肺癌化疗敏感性，而LRP的高表达与化疗耐药密切相关，因此，本实验拟用JNK信号通路特异性抑制剂SP600125抑制该通路，检测其对LRP的影响，初步探讨两者的关系及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌细胞A549来自重庆医科大学肿瘤实验室细胞库，RPMI-1640购自Gibco公司（GrandIsland，NY，USA），胎牛血清购自四季青（浙江天杭生物科技有限公司），青链霉素混合液购自Hyclone公司（Logan，UT，USA），0.25%含EDTA的胰酶购自上海碧云天生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自中国广州奕源生物科技有限公司，顺铂购自Sigma公司（St.Louis，MO，批号：p4394-25mg），SP600125购自Sigma公司（St.Louis，MO，批号：s5567-10mg），BCA工作液购自美国Thermo scientific公司（Waltham，MA），BeyoEcl plus化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，兔抗JNK1/2、P-JNK1/2购自abcam公司（Cambridge，UK），鼠抗LRP购自SANTA CRUZ公司（CA，USA），兔抗GAPDH购自北京康为世纪生物科技有限公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞用含10%胎牛血清，1%青链霉素的RPMI-1640培养液培养，放于37℃，5%CO2湿润的恒温孵箱中，细胞呈贴壁生长，每隔2～3 d换液，待细胞长到培养瓶的70%～80%时，用0.25%含EDTA的胰酶消化、传代。

1.2.2 CCK-8法检测药物对A549细胞的毒性作用 A549细胞分为2组，顺铂单药组及顺铂+SP600125组。顺铂单药组设置药物浓度梯度（0、1、2、4、8、16 μg/mL），顺铂+SP600125组先用SP600125（4 μg/mL）预处理1 h后再加入上述不同浓度的顺铂处理72 h。主要步骤：选择处于对数生长期的细胞，制备单细胞悬液，接种到96孔板中，每孔5×103个细胞，加入药物，每个浓度设3个复孔，处理72 h，加入10%CCK-8溶液，放入37℃，5%CO2湿润的恒温孵箱中1.5 h，用酶标仪测定OD值，波长为450 nm。实验重复3次。用下述公式计算抑制率：抑制率（%）=（对照组-处理组）/（对照组-空白组）×100%。用中效方程式计算IC50。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 细胞分为4组：对照组、顺铂组（16 μg/mL）、顺铂组（16 μg/mL）+SP600125（2 μ g/mL）组 、顺 铂 组（16 μ g/mL）+SP600125（4 μg/mL）组。后两组先用SP600125预处理1 h，再加入顺铂。细胞按上述处理后，每组收集1×106个细胞，用PBS洗涤2次后，加入1 mL PBS制成单细胞悬液，按Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.4 Western blot法检测蛋白表达 A549细胞分两批处理，均分为4组，第一批：对照组、顺铂2 μg/mL组、顺铂8 μg/mL组、顺铂16 μg/mL组；第二批：对照组、顺铂组（16 μg/mL）、顺铂组（16 μg/mL）+SP600125（2 μg/mL）组、顺铂组（16 μg/mL）+SP600125（4 μg/mL）组。检测各处理组细胞中JNK、P-JNK、LRP的表达，内参为GAPDH蛋白。主要步骤：细胞株处理、蛋白提取、电泳及转膜，孵一抗、二抗，显影。用Quantity One软件分析各条带吸光度值，实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 顺铂单药对LRP表达的影响

用不同浓度顺铂作用于A549细胞72 h，然后提取总蛋白，用Western blot法检测细胞中LRP的表达量。随着顺铂浓度的增加，LRP的表达量增加，其中在8 μg/mL时LRP表达量最高，而达16 μg/mL时其表达量略有下降。8 μg/mL、16 μg/mL组与对照组比较均具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

2.2 顺铂单药对JNK、P-JNK蛋白表达的影响

用不同浓度顺铂作用于A549细胞72 h，后提取蛋白，用Western blot法检测JNK、P-JNK的表达情况。随着顺铂浓度增加，P-JNK表达增多，其中在16 μg/mL时表达最多。而JNK总蛋白无明显变化（图2a）。

2.3 SP600125预处理的A549细胞JNK、P-JNK的变化情况

SP600125为JNK信号通路的特异性抑制剂，A549细胞先用不同浓度SP600125预处理1 h，然后加入16 μg/mL顺铂作用72 h后提取蛋白。用Western blot法检测JNK、P-JNK蛋白的变化情况。随着SP600125浓度增加，P-JNK表达水平逐渐降低，在4 μg/mL时P-JNK明显被抑制（图2b）。

2.4 SP600125预处理的A549细胞中LRP的变化情况

由Western blot的结果可知，用SP600125预处理的A549细胞，LRP表达水平较顺铂单药处理组低（P＜0.05），且SP600125浓度越高，LRP表达水平越低（P＜0.05，图3）。

图1 不同浓度顺铂对A549细胞LRP表达的影响Figure1 Effect of CDDP on the LRP mRNA expression in A549 cells

图2 不同浓度顺铂对A549细胞LRP表达的影响Figure2.Effect of CDDP on LRP expression in A549 cells

2.5 顺铂及SP600125联合顺铂对A549细胞的生长抑制作用

CCK-8法检测结果显示，顺铂联合SP600125组细胞生长抑制率高于顺铂单药组。用中效方程式计算的半数抑制浓度IC50。顺铂单药组IC50为9.41。SP600125+CDDP组，即先用SP600129（4 μg/mL）预处理1 h，再加入不同浓度的顺铂处理72 h。经之前的实验显示，4 μg/mL的SP600125可阻断JNK信号通路的磷酸化，但该浓度对A549细胞几乎无毒性作用（图4）。SP600125+CDDP组IC50为6.54，较顺铂单药组明显降低。由以上结果可知，用SP600125预处理的A549细胞，对顺铂的敏感性增加。

图3 用SP600125预处理的A549细胞，LRP的变化情况Figure3 Effect of SP600125 on LRP expression in A549 cells.

图4 顺铂及SP600125联合顺铂对A549细胞的生长抑制作用。与对照组比较，顺铂组除 1 μg/mL外，余均有统计学意义（P＜0.05)；SP600125+CDDP组与对照组比较均有统计学意义（P＜0.05)Figure4 Cell inhibition of CDDP or CDDP combined with SP600125(SP+CDDP)in A549 cells.Significant differences were found between the CDDP and SP+CDDP groups,except for the 1 μg/mL CDDP group(P＜0.05)

2.6 细胞凋亡率的变化

按实验设计分组，其中SP600125（2 μg/mL）+顺铂组（16 μg/mL）、SP600125（4 μg/mL）+顺铂组（16 μg/mL）分别用相应浓度的SP600125预处理1 h，然后加入16 μg/mL的顺铂处理72 h，收集细胞，用Annexin V-PI双染色法检测细胞凋亡。结果显示：顺铂组（16 μ g/mL）细胞凋亡率高于对照组（P＜0.05），SP600125（2 μg/mL）+顺铂组（16 μg/mL）高于顺铂组（P＜0.05），而SP600125（4 μg/mL）+顺铂组（16 μg/mL）高于 SP600125（2 μg/mL）+顺铂组（16 μg/mL）（P＜0.05）。由此我们得出结论，用SP600125预处理的A549细胞可增强顺铂促凋亡的作用，且随着SP600125浓度的增加其促凋亡的作用增加（图5，表1）。

图5 不同处理组A549细胞凋亡的情况Figure5 Effect of the JNK inhibitor on the CDDP-induced apoptosis in A549 cells

表1 SP600125预处理后顺铂对A549细胞凋亡情况Table1 Effect of the c-Jun N-terminal kinase(JNK)inhibitor on the CDDP-induced apoptosis in A549 cells

3 讨论

细胞凋亡的起始及完成需要细胞内外死亡通路的激活，然而多种细胞内信号通路则调控着凋亡的过程，其中包括JNK信号通路［5］。JNK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated-protein kinase，MAPK）家族主要成员之一，大量实验提示JNK信号通路在细胞分化、细胞凋亡和应激反应中起着至关重要的作用。但对于其在细胞凋亡及耐药中的作用尚存在争议。

一方面，JNK信号通路的活化促进细胞增殖、化疗耐药。Nateri等［6］研究发现敲除c-Jun基因或者特异性的使c-jun失活，可使小鼠肠道肿瘤变小，延长小鼠的寿命。Kuntzen等［7］利用SP600125和siRNA抑制JNK的活性，发现可以增强CD95介导的细胞凋亡，引起细胞周期阻滞。Cripe等［8］在对阿霉素耐药的白血病细胞株HL-60/ADR中发现JNK的持续激活和c-jun的过度表达与耐药性存在正相关，抑制JNK的活性可以降低多药耐药相关蛋白1的表达，增强细胞对药物的敏感性。Levresse等［9］发现铂类药物可使JNK持续活化和促进下游c-jun的表达，从而减少药物引起的凋亡，抑制JNK的活化可以增加小细胞肺癌的药物敏感性。李大卫等［10］发现在胃癌SGC7901和SGC7901/DDP中，用SP600125阻滞JNK信号通路，可增强该两种细胞株对顺铂的敏感性，伴P-gp的表达明显减低，说明了抑制JNK信号通路可能是通过降低P-gp的表达逆转该胃癌细胞株顺铂的耐药。

另一方面，JNK信号通路的活化促进细胞凋亡。Mansouri等［11］在对顺铂敏感的卵巢癌细胞株中，顺铂可持续激活JNK，并引起其下游c-jun的过度磷酸化，形成转录激活因子AP-1，上调死亡配体FasL的表达，从而引起细胞凋亡。Li等［12］在卵巢癌细胞株A2780和耐顺铂细胞株A2780/DDP中，转染JNK-dn基因可抑制顺铂诱导的JNK的活性，阻断顺铂诱导的细胞凋亡；转染JNK1-wt基因可使JNK持续活化，并使死亡配体FasL表达上调，细胞凋亡率增加。提示野生型JNK1基因能逆转A2780/DDP对顺铂的耐药。Sanchez-Perez等［13］研究发现 MAPK 磷酸酶CL100/MKP-1和Hvh-5的表达，可选择性的抑制CDDP诱导的JNK的激活，进而保护人类胚胎细胞（293T）免受CDDP诱导的凋亡。

由此可知，JNK信号通路在肿瘤耐药中具有双重作用，可能与细胞类型的不同、凋亡刺激物的特点、JNK活化持续时间以及其他信号通路的活化有关［5］。

本实验结果证实，在肺腺癌A549细胞中，顺铂可激活JNK信号通路，同时上调肺耐药蛋白LRP的表达，且具有浓度依赖性。用JNK信号通路抑制剂SP600125抑制JNK的磷酸化后，LRP的表达明显降低，抑制了细胞的生长，促进了细胞的凋亡。

研究发现，活化的JNK可经核转位进入细胞核激活各自的核内转录因子如 Elk-1、c-Jun、c-fos、ATP-2、p53、c-Myc以及非转录因子，如Bcl-2超家族（Bcl-2、Bcl-xl、Bim、BAD）［5］，通过磷酸化调节转录因子的活性，对基因转录进行调节，产生一系列广泛而重要的生物学效应，包括炎症、细胞生长、增殖、分化、细胞周期阻滞、凋亡等。Shimamoto等［14］发现在人结直肠癌SW-620细胞中顺铂可上调LRPmRNA及蛋白的表达，其机制可能与增强了LRP启动子的活性相关。Shinoda等［15］发现在小细胞肺癌细胞株GLC4和NCI-H82细胞株中，多柔比星可诱导MRP1和JNK的激活，用SP600125预处理或转染JNK1/2反义寡核苷酸的细胞株，可见MRP1的表达明显降低，与JNK信号通路的下游分子P-c-jun与MRP1的启动子结合，促进MRP1的表达有关。

LRP与MRP、P-gp同属于MDR的经典途径，以及活化的JNK对基因转录的调节作用，由此我们推论，活化的JNK信号通路上调LRP的表达，可能与激活的JNK信号通路相关分子与LRP启动子结合，增强其活性有关。

综上所述，JNK信号通路参与了肺癌顺铂化疗耐药途径，抑制JNK信号通路可通过下调LRP的表达增强其化疗敏感性，故对JNK信号通路的深入研究有望为肺癌治疗提供新的靶点。

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（2013-06-30收稿）

（2013-08-12修回）