超临界CO2诱变枯草芽孢杆菌的研究

鄢洪德，申屠樟萍，钱俊青

（1浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014；2浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014）

CO2是一种性质稳定、无毒性、不易燃、经济、环保的可再生资源，在Tc＞31.1℃和Pc＞7.38 MPa时达到临界状态，超临界状态下的CO2具有低粘度、高扩散的物理性质，因此具有良好的传质特性，其作为一种环境友好型溶剂，已广泛应用于萃取、反应、分析检测等多个领域[1]。近年来，超临界CO2杀灭微生物的能力也引起了广泛的关注。在适当的压力和较低温度下，超临界CO2对细菌、酵母、真菌等微生物有显著的致死效果[2-4]。此外，研究还表明超临界CO2除了影响细胞活力外，细胞代谢也会受到显著影响[5]。压力对生物系统的正常运转可进行干扰，从而诱发遗传途径的变化使得突变的发生[6]。因此，超临界CO2作为一种特殊的压力，有望成为一种新型的诱变剂。Zhang等利用超临界CO2诱变黄杆菌YY25以提高其产脂肪酶的活力，突变株比野生株的产酶活力提高了44.2%[7]。本研究利用超临界CO2诱变枯草芽孢杆菌，诱变效果以其产淀粉酶活力的变化表示，研究诱变条件，如压力、温度、诱变时间等对诱变效果的影响，进一步考察超临界CO2作为一种新型无毒的诱变剂的潜力。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis K2为实验室保藏菌种。

1.2 培养基及培养条件

斜面保存培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨1.0%，氯化钠 0.5%，琼脂 2%，pH7.0；平板计数培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.0%，氯化钠 0.5%，琼脂 2%，pH7.0；平板筛选培养基：牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.0%，氯化钠 0.5%，可溶性淀粉 0.2%，琼脂 2%，pH7.0；发酵培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨1.0%，氯化钠 0.5%，葡糖糖 0.5%，pH7.0。菌株K2划线接种于斜面培养基，培养7—8 h后，用无菌水将菌苔洗下，置于带玻璃珠的无菌三角烧瓶中。然后将该烧瓶置于45℃水浴摇床中断链24 h，使芽孢分散成单个个体。继而将该芽孢悬液置于60℃水浴中30 min，杀死残余的营养体，然后用无菌水将芽孢悬液稀释成108 cfu/mL的浓度，待用。产酶发酵培养：菌株活化后接种于发酵培养基，于37℃，200 r/min培养48 h。

1.3 超临界CO2诱变

用图1所示的超临界CO2装置处理芽孢悬液[7]。分别用75%的乙醇和无菌水清洗恒温压力容器，然后加入30 mL芽孢悬液，密封。接着CO2通过高压活塞泵注入容器。当达到设定的温度和压力后，开始计时。处理结束，打开放空阀门释放出CO2，打开接液阀门收集处理后的芽孢悬液。

1.4 细胞存活率测定

将处理后的样品和原始样品分别梯度稀释，取0.1 mL稀释液涂布于平板计数培养基，每组涂布3个平行样，37℃条件下培养48 h后观察各组样品的菌落数，根据公式C=Log(N/No)计算存活率，其中C为存活率，No是未处理的菌落数，N是处理后的菌落数。

1.5 突变筛选

1.5.1 突变初筛方法

透明圈法：将处理后的样品和原始样品分别梯度稀释，取0.1 mL稀释液涂布于平板检测培养基，每组涂布3个平行样，37℃条件下培养48 h。为便于透明圈测定，控制稀释度使检测平板上的菌落数＜10个，并对菌落进行标号，将对应菌落挑至新的平板，记上同一标号。然后在原检测培养基平板上滴加碘液，直至弥漫整个平板，稍停片刻，测量菌落形成的透明圈的大小，计算透明圈直径与菌落直径的比值（HC值）。筛选其中HC值较大的菌落保存，用于进一步复筛。

图1 超临界CO2处理系统

1.5.2 突变复筛方法（酶活力检测方法）

将HC值较大的菌株接入发酵培养基进行产淀粉酶培养，测定酶活力。菌种活化后，分别接入发酵培养基中，37℃，200 r/min培养48h。取发酵液于4 000 r/min离心10 min除去菌体，取上清液进行酶活力测定。淀粉酶活力测定采用碘比色法。取5.0 mL 0.125%可溶性淀粉溶液预热10 min后加入0.5 mL酶液，反应5 min，加入5 mL 0.1 mol/L的硫酸终止反应。取0.5 mL反应混合物和5.0 mL稀碘液混匀，显色。以加入失活酶的反应液为对照，在620 nm处测定光密度[8]。淀粉酶活力的定义为：该反应条件下，5 min水解1mg淀粉的所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

2 结果与讨论

2.1 诱变压力的影响

压力是影响微生物进化的重要因素。设定相同的处理温度37℃，在不同的压力下处理枯草芽孢杆菌的芽孢悬液，处理时间30 min。处理后菌体存活率曲线如图2所示，随着压力的增加，菌体存活率呈缓慢直线下降的趋势。不同压力下菌体的菌落直径以及透明圈直径如表1所示。结果表明，随着诱变压力的增加，除了HC值先增后减之外，菌落直径、透明圈直径并未

图2 诱变压力对存活率Log(N/No)的影响

图3 诱变压力对突变株酶活力的影响

呈现一定的规律性关系。其中，菌落直径、透明圈直径、HC值的最大值以及相应的平均值均在8.0 MPa处理时有最大值。挑选其中HC值大的菌落，进行发酵培养，检测酶活力，其结果见图3。随着诱变压力的增加，酶活力的提高百分率先增后减。在压力为8.0 MPa时达到了最高值。诱变压力从7.5 MPa增加至8.0 MPa，酶活力的提高率的变化很快。而继续增加诱变压力，酶活力则出现缓慢下降。因此进一步的实验选择诱变压力为8.0 MPa。

表1 诱变压力的影响

2.2 诱变温度的影响

图4 诱变温度对存活率Log(N/No)的影响

图5 诱变温度对突变株酶活力的影响

温度也是超临界CO2诱变的一个重要因素。Spilimbergo等[9]曾研究发现温度在CO2失活微生物的过程中起主要的作用。选择诱变压力为8 MPa，在不同的温度下处理枯草芽孢杆菌的芽孢悬液，处理时间30 min。处理后菌体存活率曲线如图4所示，曲线呈马鞍型曲线，当处理温度从33℃增加至35℃时，菌体存活率下降，但当温度增加至37℃时，菌体存活率反而上升，温度继续增加，菌体存活率又下降。这可能是因为细胞内某些修复机制被激活的缘故，因此存活率呈现暂时升高[10]。不同处理温度下菌体的菌落直径以及透明圈直径如表2所示，在39℃诱变处理下，所得到的菌落直径与平均直径最大，33℃条件下，突变菌株的透明圈及其平均值最大，而在37℃下的HC值及平均值最大。挑选其中HC值大的菌落，进行发酵培养，检测酶活力，其结果见图5。当温度从33℃到37℃之间，酶活有显著的提高，酶活提高率从1.83%上升到25.26%。当诱变温度为39℃和41℃时，突变株的酶活力皆低于原始菌株，而且，酶活力降低的趋势越明显。这与马鞍形曲线的鞍型区容易发生突变一致。因此进一步实验选择诱变温度为37℃。

表2 诱变温度的影响

2.3 诱变时间的影响

图6 诱变处理时间对存活率Log(N/No)的影响

在37℃,8 MPa下对枯草芽孢杆菌的芽孢悬液进行处理不同时间。菌体存活率曲线如图6所示，随着处理时间的延长，菌体存活率不断降低。不同处理时间菌体的菌落直径以及透明圈直径如表3所示，诱变处理30 min时，所得到的菌落的HC值及平均值最大。而其他处理时间下，突变株的HC值皆小于原始菌株。挑选其中HC值大的菌落，进行发酵培养，检测酶活力，其结果见图7。处理时间从10 min到30 min之间酶活力提高率不断增加，在30 min时达到最高值，提高约33.1%。但是，处理时间为10 min时，酶活力小于原始菌株的酶活力，说明此时突变株多为负突变。而在30 min之后，直到50 min，酶活力的提高百分率在不断地减小。在处理时间为50 min时，酶活提高率小于0，也即此时突变株多为负突变。

图7 诱变处理时间对酶活提高百分率的影响

表3 诱变时间的影响

3 结 论

通过超临界CO2诱变淀粉酶产生菌Bacillus subtilis K2，对诱变条件如压力、温度、时间进行了考察，发现最佳的诱变条件为：压力8.0 MPa，温度37℃，时间30 min。并从中筛选出一株酶活力提高约33%的突变株，说明超临界CO2可作为一种绿色的有潜力的诱变剂。

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