活性氧介导砷诱导的蚕豆保卫细胞死亡

薛美昭，仪慧兰

山西大学生命科学学院，太原030006

自然状态下，砷以较低浓度广泛存在于大气、水和土壤中。近年来砷化合物在工、农、医药业中的大量使用导致了环境的砷污染，部分地区土壤和水域环境中砷含量偏高，对生态系统和人类健康构成威胁[1]。氧化损伤是目前公认的砷毒性作用机制:无机砷可诱发生物机体内超氧阴离子(O2·-)，羟基自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)的生成，这些活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)能破坏细胞膜及胞内生物大分子如膜脂、蛋白和核苷酸[2]，进而影响细胞和分子的结构与功能，使细胞生理功能紊乱，导致疾病发生甚至死亡。近期研究证实，胞内一定水平的ROS 分子具有信号分子的功能，参与介导多种生物学过程，但是ROS 在砷毒性作用过程中的信号作用机制还不清楚。

植物叶表面的气孔保卫细胞能够对多种内外刺激如光、湿度、CO2和激素等做出反应，是研究信号转导的模式实验系统[3-4]，对环境变化反应灵敏而准确。近期，不少学者采用植物叶面保卫细胞研究环境污染物氰化物、二氧化硫和铝等的细胞毒性，揭示了环境化学物的毒性效应及其作用途径[5-7]，发现了内源性ROS 在细胞死亡中的作用。因此，本研究以蚕豆气孔保卫细胞为实验模型，研究NaAsO2对气孔保卫细胞的毒性效应，为揭示砷毒性作用机制提供实验依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

蚕豆(Vicia faba L.)种子清洗后用自来水浸泡48 h，25℃湿纱布包裹催芽2 ～3 d，然后播种于较肥沃的营养土中。培养条件:光暗周期为14 h/10 h，温度18 ～25℃，光照强度240 μmol·m-2·s-1。幼苗长至4 周时取顶端第2 节完全展开的叶片，选非叶脉部位用镊子撕取其下表皮，切成长约1 cm、宽约0.5 cm 的表皮条，置于含2-(N-morpholino)ethanesulfonic(MES)的表皮条缓冲液中。MES 缓冲液含MES，用三羟甲基氨基甲烷调节pH 至7.0。

1.2 药物处理

用MES 缓冲液配制含NaAsO2浓度为0.1、0.3、1、3 和10 mg·L-1的溶液作为砷处理液。缓解组采用一定浓度拮抗剂分别与NaAsO2同时作用。MES 缓冲液作对照。每个处理用3 个不同蚕豆植株上的叶片，将表皮条置于含有不同药物的处理液中，于23℃光照3 h 后检测细胞活性和胞内ROS 水平。

依据文献资料，在砷处理液中加入外源抗坏血酸(AsA，1 mmol·L-1)和过氧化氢酶(CAT，1 000 U·mL-1)来降低砷胁迫引发的胞内ROS 升高[8]，选用Ca2+特异性螯合剂乙二醇双四乙酸(EGTA，1 mmol·L-1)和质膜Ca2+通道抑制剂降低胞内Ca2+水平[7]，用0.1 mmol·L-1的2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(PD98059)抑制促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activate protein kinase,MAPK)活性[9]。

1.3 细胞活性检测

参照Yi 等实验方法[7]，药物处理结束后，表皮条用0.1 mg·L-1的二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)暗染10 min，荧光显微镜下观察、拍照。统计无绿色荧光的保卫细胞(死细胞)数与观察的保卫细胞总数，计算保卫细胞死亡率。每个处理至少选用3 个植株的不同叶片，每次至少观察2 000 个保卫细胞。保卫细胞死亡率(%)=死亡保卫细胞数/观察保卫细胞数×100%。

1.4 胞内ROS 水平检测

参照González 等的实验方法[10]，药物处理结束后表皮条于10 μmol·L-1的活性氧荧光指示剂2',7'-二氯荧光黄双乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)中暗孵育30 min 后，荧光显微镜(激发波长488 nm)下观察并拍照。使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0 测量每组3 个表皮条中约300 个细胞的荧光值，计算其平均值。将对照组荧光值计为1，各处理组的相对荧光值为处理组荧光值与对照组的比值。

1.5 数据分析

计算每组3 个重复实验的平均值和标准误，采用SPSS17.0 对实验结果进行F 检验后，采用Duncan 方法进行多重比较，分析不同处理组和对照组之间的差异显著性。

2 结果(Results)

2.1 砷处理对蚕豆保卫细胞活性的影响

根据FDA 染色原理，活细胞发出亮绿色荧光，若细胞荧光亮度降低说明细胞活性下降，不能很好地将FDA 水解为极性荧光素分子，将无绿色荧光的细胞记为死细胞。研究发现，0.1 mg·L-1的NaAsO2对保卫细胞活性无明显影响，0.3 ～10 mg·L-1的NaAsO2能致蚕豆气孔保卫细胞活性降低，且随着NaAsO2浓度的升高细胞存活率逐渐下降，10 mg·L-1处理组存活率下降了28.4%(图1)，浓度大于10 mg·L-1时，多数细胞荧光微弱，显示细胞活性很低。

2.2 砷处理对蚕豆保卫细胞内ROS 水平的影响

用ROS 荧光探针DCFH-DA 标记后检测发现，对照组保卫细胞具较弱的绿色荧光，3 与10 mg·L-1的NaAsO2处理组保卫细胞内ROS 荧光信号强度明显增强，即胁迫组胞内ROS 水平升高(图2)。由此可见，砷处理组细胞活性降低伴随着胞内ROS 水平的升高。

图2 砷对蚕豆保卫细胞内ROS 水平的影响Fig.2 Changes of relative intensity of ROS fluorescence in V.faba guard cell exposed to arsenic

为证实ROS 与细胞死亡的关系，用一定浓度的抗氧化剂AsA 或CAT 与NaAsO2共同作用，检测ROS 水平降低后细胞死亡率的变化，发现2 种类型的抗氧化剂均可显著抑制砷诱发的细胞死亡(图3)。处理液中加入1 mmol·L-1的AsA 能抑制砷引起的细胞死亡，提高细胞存活率，使3 与10 mg·L-1NaAsO2处理组细胞存活率分别提高14.1%和23.5%;加入浓度为1 000 U·mL-1的CAT 同样能够显著降低砷诱导的细胞死亡率，使3 与10 mg·L-1NaAsO2组细胞存活率分别提高了15.4%和25.6%。研究结果表明，砷诱导的保卫细胞死亡与胁迫过程中胞内ROS 水平升高密切相关，ROS 参与介导了砷诱导的细胞死亡。

图3 抗氧化剂抗坏血酸(AsA)与过氧化氢酶(CAT)对砷致蚕豆保卫细胞死亡的抑制作用Fig.3 Antagonistic effects of antioxidants(AsA and CAT)on As-induced guard cell death in V.faba

2.3 Ca2+和MAPK 参与砷诱发的细胞死亡

在砷处理液中加入一定浓度的Ca2+干扰剂降低胞内Ca2+水平后，细胞存活率提高，死亡率下降(图4)。处理液中加入的Ca2+特异性螯合剂EGTA 后，3 和10 mg·L-1NaAsO2组细胞存活率分别提高4.3%和15.9%，与砷单独处理组相比均显著增高(P ＜0.05);加入0.1 mmol·L-1的Ca2+通道抑制剂LaCl3后，3 和10 mg·L-1NaAsO2处理组细胞存活率分别提高了15.0%和24.6%，亦显著高于砷单独处理组(P ＜0.05)。这表明，砷诱导的保卫细胞死亡与胁迫引发胞内Ca2+水平升高有关，在胞内Ca2+升高过程中胞外Ca2+内流发挥了重要作用。

用0.1 mmol·L-1的MAPK 抑制剂PD98059 与NaAsO2共同处理蚕豆表皮条后，保卫细胞存活率显著高于砷单独处理组(P ＜0.05)，3 mg·L-1砷处理组死亡率接近对照水平(图5)，说明MAPK 参与了砷诱发的细胞死亡过程。

图4 EGTA 与LaCl3对砷致蚕豆保卫细胞死亡的抑制作用Fig.4 Antagonistic effects of EGTA and LaCl3 on As-induced guard cell death in V.faba

图5 MAPK 抑制剂PD98059 对砷致蚕豆保卫细胞死亡的抑制作用Fig.5 Antagonistic effect of MAPK inhibitor PD98059 on As-induced guard cell death in V.faba

3 讨论(Discussion)

植物暴露于无机砷中会激发ROS 的产生，ROS具有很强的氧化能力，能直接破坏植物体内蛋白质、核苷酸、膜脂等生物大分子的结构，引发脂质过氧化反应[11]，ROS 还可作为信号分子介导多种生物学过程。

本研究发现，NaAsO2处理诱发保卫细胞死亡和胞内ROS 水平升高同期发生。外源性给予ROS 清除剂AsA 和CAT 可降低非生物胁迫诱发的胞内ROS 水平[8]，在NaAsO2处理液中加入AsA 或CAT后，NaAsO2诱发的细胞死亡被抑制，说明NaAsO2诱发蚕豆保卫细胞死亡与胞内ROS 升高有关，砷胁迫下保卫细胞内ROS 水平升高介导了蚕豆保卫细胞的死亡。本结果为ROS 参与砷毒性作用过程提供了直接证据。

MAPK 途径是氧化还原敏感的信号途径，可受ROS 调节。特异性激酶抑制剂PD98059 能抑制MAPK 的激活[9]，从而阻断MAPK 信号通路。本研究中加入MAPK 抑制剂PD98059 后能显著抑制砷处理诱发的保卫细胞死亡，表明MAPK 可能作为ROS 下游信号参与介导了砷诱导的蚕豆保卫细胞死亡。

研究表明，胁迫产生的过量ROS 可激活质膜Ca2+通道和胞内Ca2+通透性离子通道，引起胞外Ca2+内流，导致胞内Ca2+水平升高[7,12-13]。Ca2+特异性螯合剂EGTA 能通过螯合作用降低细胞外Ca2+浓度从而有效阻止胞外Ca2+内流;LaCl3作为Ca2+通道特异性抑制剂，能有效阻止胞外Ca2+进入细胞;因此，加入外源EGTA 或LaCl3能有效降低胞内Ca2+[7]。本研究中，加入EGTA 或LaCl3后砷处理组细胞死亡率均显著降低，说明胞内Ca2+升高参与介导了砷诱发的细胞死亡，胞外Ca2+内流是胞内Ca2+升高的重要原因。因此，砷处理组蚕豆保卫细胞内ROS 水平升高可能通过激活质膜Ca2+通道，使胞外Ca2+内流，导致胞内Ca2+水平升高，从而激活相关下游信号引发细胞死亡。

胞质中Ca2+超载可影响细胞核与线粒体内的Ca2+水平，在Ca2+失衡的条件下基因表达、能量代谢、线粒体膜通透性等发生改变，可引发细胞坏死、凋亡、自噬性死亡[14]。细胞死亡信号途径中有很多Ca2+靶标，包括蛋白激酶、NO 合酶、核酸内切酶、磷脂酶、蛋白磷酸化酶、转谷氨酰胺酶、蛋白酶等。

依据细胞毒性机制研究理论，结合本研究结果，笔者认为，砷诱发植物细胞死亡可能通过下述3 条途径:(1)胁迫产生的ROS 可直接攻击DNA、蛋白质等生物大分子，使DNA 分子断裂、修复酶活性降低，DNA 损伤无法及时修复，导致细胞死亡[15];(2)ROS 激活质膜Ca2+通道，使胞外Ca2+内流，胞内Ca2+水平升高，进而激活Ca2+依赖性核酸内切酶，使细胞核DNA 在核小体连接处被切割，细胞凋亡;(3)胞内ROS 和Ca2+水平升高使线粒体膜通透性破坏，细胞色素c、凋亡诱导因子释放并于胞质中形成凋亡复合体，激活类Caspase 蛋白酶，特异性切割下游底物，细胞凋亡[16-17]。虽然砷胁迫可能激活多种细胞死亡途径，但本结果为细胞死亡的程序性调控提供了直接证据。

综上所述，一定浓度的砷可诱发蚕豆保卫细胞死亡，砷胁迫诱发胞内ROS 水平升高，ROS 激活质膜Ca2+通道，使胞外Ca2+内流，胞内Ca2+水平升高，激活了胞内Ca2+信号系统，Ca2+可激活细胞内死亡相关基因表达执行细胞死亡程序，引发细胞死亡。用植物细胞研究了砷毒性作用的信号途径，该途径与动物细胞中报道的结果相似[18-19]，说明植物细胞在检测环境有毒物质的测试中同样有效，而运用蚕豆叶面气孔保卫细胞检测环境化学物的细胞毒性，具有取材简便、检测灵敏快速、重复性好等优点，因此，该方法可用于对环境化学物质毒性作用的检测和评价。

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