土著细菌对江汉平原浅层含水层沉积物中砷迁移的影响

谢作明，罗艳，王焰新，周义芳，孙小燕，甘义群

中国地质大学(武汉)环境学院，武汉430074

砷是普遍存在于岩石圈、水圈和生物圈中的一种无色无味的剧毒类金属，随着饮水型砷中毒事件不断在世界各地被报道[1-5]，地下水中高浓度砷已经成为主要的公众健康问题[6]，引起了各国政府和研究者的广泛关注。

有研究报道，我国高砷地下水主要分布在内蒙古、山西、新疆、宁夏和台湾等8 个省和自治区[7-10]。然而，在对江汉平原地质环境调查中发现，该地区的地下水砷含量远超国家饮用水标准。江汉平原是我国重要的产粮区，砷在该地区浅层地下水系统中富集，在江汉平原种植的水稻将增加人体健康风险，从而扩大我国砷中毒暴露人口数量。因此，迫切需要加强该地区高砷地下水的防治，而高砷地下水防治策略制定的前提，是需要对地下水富砷成因机理全面深入的了解。

但是，到目前为此，对地下水富砷成因机理的研究大多将生物因子和非生物因子分割开来。实际上，地下水富砷成因是多种因素造成的，而生物与非生物因子如何协同影响高砷地下水的形成却鲜有研究报道。

本研究利用高砷沉积物中土著细菌为生物材料，不同砷含量沉积物为研究对象，结合不同生物量和pH 条件在室内开展厌氧培养实验，探讨微生物活动对沉积物中砷迁移和转化的影响。研究结果有助于完善地下水富砷成因机理。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 沉积物的采集及砷形态分析

根据前期调查地下水砷含量结果，选定江汉平原仙桃市沙湖镇(30°09'N，113°41'E)为含水层沉积物采样位点，于2011 年11 月钻孔采样，孔深50 m。采集不同层位的原状土，利用保鲜膜密封，然后装入密封袋，再密封在PVC 管内，快速运回实验室，在4℃下避光保存。实验所用沉积物来自埋深9 ～15 m 的含水层。测得采样点地下水pH 值为7.3。

选取3 个岩性特征相似，已知砷含量的沉积物样，分别设为S1、S2 和S3，砷含量分别为14.8、23.6和30.2 μg·g-1。去除表面污染层，于121℃下灭菌30 min，过夜冷却后重复灭菌1 次，以保证沉积物灭菌彻底。

1.2 细菌培养

样品运回实验室后，立刻在YQX-II 厌氧手套箱(常州恒德仪器公司)中选取约50 g 沉积物，破碎后放进已装有300 mL 无菌营养肉汤培养基(简称NB 培养基)[11]的三角瓶中，橡皮塞封口，用力摇匀，置于厌氧手套箱中培养，每隔6 h 摇匀1 次。培养1 d 后取50 mL 的悬浮液，接入300 mL 新鲜的无菌NB 培养基中，继续培养2 d。依此方式再扩大培养1 次，待用。

1.3 实验方案

从已灭菌的S2 样品中分别称取100 g 沉积物，置于1 000 mL 三角瓶中，并加入500 mL 已灭菌的NB 培养基。向三角瓶中分别加入上述菌悬液50、100 和150 mL，设置3 个不同细菌生物量处理组，前2 组三角瓶中分别补充100 和50 mL 去离子无菌水，使各三角瓶中总液体体积相同，橡皮塞封口。为了营造厌氧培养条件，每12 h 向三角瓶的溶液中注入氮气10 min。所有混合液均在25℃的培养箱中避光培养。另称取2 份沉积物，设定2 个对照组(CK1 和CK2)，CK1 既没有接种细菌也没有加入营养肉汤培养基，而是直接加入650 mL 无菌去离子水，CK2 没有接种细菌但加入650 mL 营养肉汤培养基。对照组与实验组的培养条件完全一致。以上所有操作均在无菌条件下进行，每个处理均设置3 个平行。

从S1 和S3 中称取沉积物，设定细菌处理组，但只接种上述菌悬液100 mL，培养条件与上文一致。

另外，从S2 中称取沉积物，如设置实验组，接种菌悬液100 mL，利用0.1 mol·L-1HCl 和0.1 mol·L-1NaOH 调节混合液的pH 值，使起始pH 分别为5、7 和9，培养条件与上文一致。

1.4 样品分析

在不同培养时间间隔内分别从三角瓶中取20 mL 悬浮液。所取样品在5 000 r·min-1下离心20 min。上清液再用0.45 μm 滤膜过滤，滤液中砷形态及含量按Le 等[12]方法测定。

1.5 数据分析

数据采用平均值±标准差表示，相关数据的计算及统计分析使用SPSS 19.0 软件，并用Origin 8.0 作图。

2 结果(Results)

2.1 细菌的生物量对沉积物中砷迁移的影响

不同生物量处理条件下，沉积物-培养基悬浮液中砷含量随培养时间的变化如图1 所示。图1a 显示的是悬浮液中总砷含量的变化。可以看出，细菌接入1 d 后，在培养的悬浮液中就检测到砷，并随培养时间的延长而快速增加，而没有接入细菌的2 个对照(CK1 和CK2)悬浮液中砷含量变化很小，特别是沉积物-去离子水的对照(CK1)悬浮液中砷含量更低，实验期间最高也只有12 μg·L-1，沉积物-培养基的对照(CK2)悬浮液中砷含量在培养14 d 后达到最高，为35 μg·L-1。在初始接种菌悬液为50、100 和150 mL 的3 个细菌处理组中，砷含量在接种后的第2 ～10 天内快速增加，实验期间最高分别达到269、541 和584 μg·L-1，其中150 mL 菌悬液细菌处理组在第18 天比第14 天的砷含量低。这些结果表明，细菌活动能加速沉积物中的砷释出，且随环境中细菌生物量的增加而加强。从图1a 中还可以看出，在培养的前4 天内，100 mL 菌悬液处理组的总砷释出量明显低于150 mL 菌悬液处理组，而从第6 天开始，两者的总砷释出量差距缩小。因此，作者推断:随着总砷含量的增加，细菌活性下降，导致砷释出速度下降，从而出现在实验后期，100 mL 和150 mL菌悬液处理组的总砷释出量差距逐渐缩小的情况。

细菌活动下悬浮液中As(III)含量变化如图1b 所示。由图可知，As(III)含量变化总体上与总砷变化趋势一致。结合图1a 和图1b 可以看出，悬浮液中总砷以As(III)为主。即使初始接种菌悬液为150 mL 的处理组，在培养第18 天的As(III)含量也没有出现下降。在整个培养过程中，2 个对照菌悬液的As(III)含量同样也保持较低水平，几乎没有增加。这说明接种菌悬液更有利于沉积物中As(III)的释出。

图1 接种不同生物量菌悬液条件下悬浮液中总砷(a)和As(III)(b)浓度随培养时间的变化注:CK1 表示既没有接种细菌也没有补充培养基的对照;CK2 表示补充培养基但没有接种细菌的对照。Fig.1 Temporal changes of total As(a)and As(III)(b)concentrations in suspension solution during incubation with different bacterial biomass

2.2 细菌对沉积物中砷迁移的影响

图2 展示出细菌对不同沉积物中砷迁移的影响。可以看出，在接种细菌初始生物量相同的情况下，不同砷含量沉积物中的砷均快速释出。但是，由S2 和S3 沉积物与菌悬液和培养基组成的处理组中，总砷和As(III)的释出量差别都较小。3 个处理组悬浮液中总砷和As(III)的含量在培养结束时均达到最高，总砷分别为:422、541 和561 μg·L-1，As(III)分别为:298、391 和414 μg·L-1。所释出的总砷分别占沉积物中初始总砷的18.5%、14.9%和12.1%，而悬浮液中As(III)分别占已释出总砷的70.6%、72.3%和73.8%。可以得出的结论是:在初始生物量一定的条件下，沉积物中砷含量越高，细菌活动下总砷相对释出量就越低;而且As(III)占所释出总砷的比值就越高。

图2 细菌作用于不同砷含量沉积物时悬浮液中总砷(a)和As(III) (b)浓度随培养时间的变化注:S1、S2 和S3 分别表示砷含量为14.8、23.6 和30.2 μg·g-1 的沉积物样品。Fig.2 Temporal changes of total As(a)and As(III)(b)concentrations in suspension solution during bacterial incubation from sediments with different arsenic contents

2.3 不同pH 条件下细菌对沉积物中砷迁移的影响

细菌在不同pH 条件下对沉积物中砷释出的影响如图3 所示。当悬浮液初始pH 值为5、7 和9时，在细菌活动下，砷都能从沉积物中释出，只是pH值为5 的处理组中砷的释出最慢，另2 个处理组的释出较快。在培养的前8 天，弱碱性pH 9 处理组的砷迁移量较pH 7 处理组的低，随后超过pH 7 处理组。经过18 d 的培养后，3 个处理中总砷释出量占沉积物初始总砷的7.7%、14.7%和15.1%，悬浮液中As(III)分别占已释出总砷的77.6%、80.9%和92.1%。说明在酸性条件下，细菌对砷释出的影响最弱，而在弱碱性和中性条件下，细菌对砷释出的影响差别较小，并且弱碱性更有利于As(III)的释出。

图3 细菌在不同初始pH 值条件下悬浮液中总砷(a)和As(III)(b)浓度随培养时间的变化Fig.3 Temporal changes of total As(a)and As(III)(b)concentrations in suspension solution during bacterial incubation with different initial pH

3 讨论(Discussion)

本研究表明，在厌氧培养条件下，土著细菌的活动加速了砷从沉积物向悬浮液迁移，而且还发现释出的砷以As(III)为主。这与作者在江汉平原监测到地下水中含有高浓度砷，并且以As(III)为主的结果一致。同时，作者实验室利用16S rDNA 克隆文库方法对该钻孔中地下水系统细菌多样性分析，发现该含水层沉积物中有大量微生物存在，而且其优势菌群主要由伯克氏菌目(Burkholderiales)、假单胞杆菌目(Pseudomonadales)和肠杆菌目(Enterobacteriales)构成，这些细菌为该地区浅层地下水富砷提供了重要的生物条件。江汉平原是典型的农耕区，长期的垦殖使得地下水中富含有机质，这为微生物提供了有利的生长条件。

细菌加速沉积物中砷迁移可能的原因是:在厌氧条件下，细菌通过富集砷，在胞内将As(V)还原成As(III)，然后排出胞外，导致As(III)浓度增加[13];As(III)的迁移能力比As(V)强[14]，导致沉积物中砷脱离结合位点[15]被释放。也可能因为沉积物中Fe(III)被土著细菌还原成Fe(II)，As(V)同时也被还原成As(III)，与Fe 一起共同从沉积物表面解吸[16]。这可以从培养结束后，悬浮液中的砷以As(III)为主得到证明。

在不同初始生物量对砷迁移的影响研究中，发现细菌活动对砷迁移的影响随生物量的增加而加强。但是，当生物量增加到一定程度后，在培养后期，150 mL 菌悬液处理组无论是总砷还是As(III)的迁移相对于100 mL 菌悬液处理组都有减慢的趋势。这可能是由于细菌生物量增加，悬浮液中营养物质减少，生物活性降低，从而使细菌对砷迁移的作用降低所致。也可能是由于悬浮液中砷特别是As(III)的浓度增加，砷钝化细菌胞内酶活性[17]，影响细菌生长，使悬浮液中细菌生物量减少，从而降低细菌对砷迁移的影响。

本研究结果显示，沉积物中砷含量越高，细菌活动下总砷的相对释出量越低;而且As(III)占释出总砷的比值越高。众所周知，砷是一种有毒类金属物质，沉积物中以无机砷为主，其中As(III)对生物的毒性更强[18-21]。砷不仅影响细菌细胞的形态发育，而且抑制细菌的代谢[22]。因此，当沉积物中砷含量超过土著细菌的耐受范围时，将对细菌产生毒害作用，从而降低细菌对砷迁移的影响。

在不同的pH 条件下培养细菌悬浮液，对沉积物中砷的释放具有一定差异。酸性处理组比碱性处理组的砷迁移低，说明碱性条件有利于砷从沉积物中迁移。Park 等[23]研究发现，碱性环境有利于砷从河床沉积物中解吸附，并且，吸附在沉积物颗粒表面的砷很容易受pH 值的变化脱离结合位点，游离到液相中。当然，酸性和碱性条件都不利于菌悬液中细菌的生长，这是砷迁移受到影响的最主要原因。本研究中，弱碱性处理组在培养的前8 天内，砷迁移量较pH 7 处理组的低，随后超过pH 7 处理组。可能是因为细菌在接种后没有适应碱性环境，细菌发育和繁殖受到抑制，经过一定时间培养后，胞内抗氧化防御系统被激活，细菌抵抗高砷环境的能力增强而快速生长[17];也可能是因为细菌分泌的代谢产物降低了悬浮液的pH 值[21,23-24]，改善了生长条件，因此细菌得以快速生长，从而提高了菌悬液中细菌的砷迁移能力。作者调查发现，江汉平原浅层地下水系统属于弱碱性环境。另外，大量细菌的长期活动，导致了该地区沉积物中砷向地下水中富集，而形成高砷地下水。

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